הערכת ספיגת גלוקוז בתאי העצב המוטוריים של זחלי דרוזופילה עם חילוף חומרים מווסת של גלוקוז

הנח זחלי בקרה ומוטציה של דרוזופילה בכלים נפרדים המכילים בופר נטול גלוקוז.

נתח את הזחלים כדי להסיר איברים פנימיים, תוך חשיפת מערכת העצבים המרכזית או מערכת העצבים המרכזית.

מערכת העצבים המרכזית כוללת חוט עצב גחוני המכיל נוירונים מוטוריים. בזחלים המוטנטיים, נוירונים אלה מציגים חילוף חומרים מוגבר של גלוקוז.

נוירונים מוטוריים בשתי הקבוצות מבטאים חיישני גלוקוז תוך תאיים המכילים פלואורופורים תורמים ומקבלים.

מקם את הזחלים מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי. עם עירור, הפלואורופור התורם פולט פלואורסצנטיות.

אתר את הנוירונים המוטוריים באמצעות הקרינה הזו.

החלף את המאגר בתמיסה עם תוספת גלוקוז.

גלוקוז נכנס לתאי העצב, נקשר לחיישנים ומעורר שינוי קונפורמציה שמביא את שני הפלואורופורים לקרבה.

עם עירור, המקבל סופג את האנרגיה הנפלטת מהתורם, המכונה העברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית או FRET, ופולט פלואורסצנטיות.

אות ה-FRET נמצא בקורלציה עם ספיגת הגלוקוז. עוצמת אות מקבל גבוהה יותר בזחלים המוטנטיים בהשוואה לבקרה מצביעה על חילוף חומרים מוגבר של גלוקוז.

לפני תחילת הנתיחות, הפעל את מיקרוסקופ ההדמיה והלייזרים. לאחר מכן, אסוף זחל כוכב שלישי נודד. שוטפים אותו במים מזוקקים כפולים ומניחים אותו בטיפת מאגר HL3 על צלחת מרופדת באלסטומר שהוכנה בעבר.

לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ מנתח, השתמש בזוג מלקחיים כדי להצמיד את הקצוות הקדמיים והאחוריים של הזחל, הצד הגבי כלפי מעלה, על ידי מתיחה זהירה של הזחל לאורכו בעזרת סיכות חרקים. בעזרת זוג מספריים זוויתיים, בצע חתך ממש מעל הסיכה האחורית. לאחר מכן בצע חתך אנכי מהחתך לכיוון הקצה הקדמי של הזחל.

לאחר הוספת כמה טיפות של מאגר HL3, במידת הצורך, הסר את קנה הנשימה ואת שאר האיברים הצפים מבלי להפריע למערכת העצבים המרכזית. לאחר מכן, הצמידו את הדשים, מותחים את דופן הגוף, כדי לחשוף את מערכת העצבים המרכזית תוך שמירה על המערכת העצבית-שרירית שלמה.

לרכישת תמונה, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי זקוף עם עדשת טבילה במים פי 40. לאחר מכן, בחר בלייזר 405 ננומטר כדי לרגש את ה-CFP. לאחר מכן, בצע אופטימיזציה של פרמטרי הרכישה, כגון מהירות סריקה, ממוצע, מטרה, גודל חור זום ורזולוציה מרחבית. התאם את ההגבר כך שהאות יהיה בטווח הדינמי האופטימלי, והשתמש באותם פרמטרים עבור כל הגנוטיפים.

כדי לדמות נוירונים מוטוריים בתוך חוט העצב הגחוני, הנח את צלחת הסיליקון עם הדגימה המנותחת מתחת לעדשה, והורד את העדשה כך שתבוא במגע עם סוכרוז הטרהלוז HL3. ודא שהעדשה שקועה לחלוטין במאגר והוסף מאגר נוסף במידת הצורך.

לאחר מכן, באמצעות ערוצי CFP ו-FRET, בחר ידנית בחירה אופטית המורכבת מלפחות 6 נוירונים מוטוריים במוקד, הממוקמים לאורך קו האמצע של חוט העצב הגחוני. לאחר מכן, רכשו תמונות כל 10 שניות או 10 דקות. תמונות אלה מייצגות את קו הבסיס.

לגירוי גלוקוז, הסר את סוכרוז הטרהלוז המכיל מאגר HL3 באמצעות פיפטה פסטר, והוסף מאגר HL3 בתוספת גלוקוז של 5 מילי-מולרי מבלי להזיז את חוט העצב הגחוני. לאחר מכן, רכשו תמונות כל 10 שניות למשך 10 דקות נוספות.

תמונות אלה מייצגות את שלב הגירוי. שמור את התמונות כקובצי dot czi, או כל סוג קובץ הנתמך על-ידי תוכנת ההדמיה עם שם קובץ הכולל תאריך, רקע גנטי, מצב ניסוי וערוצים שבהם נעשה שימוש. שימוש חוזר בפרמטרים כדי לדמות את כל הגנוטיפים.