צביעה חיסונית של אסטרוציטים בעלי תווית פלואורסצנטית בקטע רקמת מוח של עכבר

קחו קטע קבוע של רקמת מוח של עכבר המכיל אוכלוסייה דלילה של אסטרוציטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי.

טפל בחלק הצף החופשי עם מאגר המכיל חומר ניקוי כדי לחלחל לתאים.

דגרו את החלק במאגר חוסם כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

טפל בקטע בנוגדנים ראשוניים ודגר כדי לאפשר לנוגדנים להיקשר לחלבונים הפלואורסצנטיים באסטרוציטים.

שטפו את כל הנוגדנים הראשוניים העודפים באמצעות חוצץ.

לאחר מכן, דגרו את הקטע עם נוגדנים משניים מתויגים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.

שטפו נוגדנים משניים לא קשורים עם מאגר.

העבירו את החלק לתערובת מים נטולת יונים כדי להסיר שאריות חומרי ניקוי.

הנח את החלק על שקופית המכילה מים נטולי יונים. הסר עודפי נוזלים והוסף אמצעי הרכבה. לאחר מכן, מקם כיסוי ואבטח אותו.

לבסוף, השתמש במיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לדמיין את האסטרוציטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בתוך הקטע.

כדי להתחיל, הכינו תמיסה טרייה של TBST על ידי הוספת 1 מיליליטר של 10% טריטון X לצינור של 50 מיליליטר ומילוי הצינור ל -50 מיליליטר ב- TBS. הכן 2 מיליליטר של תמיסות חסימה ונוגדנים לכל מוח על ידי שילוב סרום עיזים ו- TBST בצינור של 15 מיליליטר.

לאחר מכן, סמן צלחת של 24 בארות כדי למקם דגימות שונות בשורות שונות, בתמיסות שונות, בעמודות שונות. לאחר מכן, הוסף 1 מיליליטר של TBST לשלושת העמודות הראשונות המסומנות כ-'Wash 1', 'Wash 2' ו-'Wash 3', והוסף 1 מיליליטר של תמיסת חסימה לעמודה הרביעית.

הכן קיסם זכוכית על ידי המסת קצה פיפטה פסטר בגודל 5.75 אינץ 'לוו קטן באמצעות מבער בונסן . לאחר מכן העבירו קטעי רקמות מצלחת 12 הבארות לעמודת 'שטיפה 1' של צלחת 24 הבארות באמצעות הפיק. לאחר מכן שטפו את החלקים במשך 10 דקות כל אחד בבארות שטיפה 1, 2 ו-3 על ידי שימוש בפיק הזכוכית כדי להעביר את החלקים מבאר אחת לאחרת, ולאחר מכן דגירה של החלקים למשך שעה בתמיסת החסימה.

לאחר מכן, דגרו את החלקים בנוגדנים ראשוניים במשך שניים עד שלושה לילות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול. לאחר דגירה ראשונית של נוגדנים, יש לשאוב את היום הראשון TBST מבארות השטיפה. לאחר מכן הוסף 1 מיליליטר TBST חדש לכל באר כביסה, והעביר את החלקים לבאר הכביסה הראשונה.

לאחר מכן, דגרו קטעים בנוגדנים משניים למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. לאחר דגירה משנית של נוגדנים, יש לשאוב את היום השני TBST מבארות השטיפה. לאחר מכן הוסף 1 מיליליטר TBST חדש לכל באר כביסה והעביר את החלקים לבאר הכביסה הראשונה.

במהלך הכביסה הסופית, הוציאו את אמצעי ההרכבה מ-4 מעלות צלזיוס והניחו לו להתחמם לטמפרטורת החדר. לאחר מכן מכינים תערובת של 2 עד 1 של TBS במים נטולי יונים ומוסיפים אותה לצלחת פטרי. לאחר מכן, הכינו שקופית מיקרוסקופ על ידי הוספת 800 מיקרוליטר של תערובת של 2 עד 1 של TBS במים נטולי יונים לפני השטח.

מעבירים את החלקים מבאר 'Wash 3' לצלחת הפטרי. לאחר מכן, בעזרת מכחול עדין, העבירו את החלקים בזה אחר זה מצלחת הפטרי לנוזל שעל השקופית. לאחר מכן, סדרו בזהירות את החלקים כך שיהיו שטוחים על השקופית בעזרת מברשת הצבע. הסר בזהירות עודפי נוזלים מהמגלשה בעזרת פיפטה P1000, ואחריה שאיבת ואקום.

לאחר הסרת כל הנוזלים העודפים מהמגלשה, השתמש בפיפטה להעברה כדי להוסיף מיד טיפה אחת של אמצעי הרכבה לכל חלק ולהניח בעדינות כיסוי מעל המגלשה. אפשר למדיית ההרכבה להתפשט למשך מספר דקות, ולאחר מכן הסר את כל אמצעי ההרכבה העודף שיוצא מתחת לכיסוי על ידי שאיבת ואקום. לאחר מכן, אטמו את כל ארבעת הקצוות של הכיסוי עם לק שקוף.