השגת תרחיף של תא בודד מרקמת מוח של חולדה קפואה

הפשירו קטע מרקמת מוח קפואה של חולדות.

מוסיפים חיץ וטוחנים את הרקמה. לאחר מכן, העבירו אותו לצינור המכיל חיץ וערבבו.

צנטריפוגה את התערובת והשליכו את הסופרנטנט.

הוסף תמיסת אנזים פרוטאוליטי לרקמה והשהה אותה מחדש באמצעות פיפטה בקוטר גדול.

דגרו את התערובת כדי לפרק את המטריצה החוץ-תאית, ולשחרר את התאים העצביים.

צנטריפוגה את התערובת והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את שברי הרקמה במאגר מקורר והפעילו אותם שוב ושוב כדי לנתק את התאים.

אפשר לפסולת ולתאים הלא מנותקים להתייצב, ואז העביר את התרחיף החד-תאי לצינור חדש.

מעבירים את התאים לאתנול קר כקרח ומערבבים. דגרו אותם כדי לתקן ולחלחל את התאים.

צנטריפוגה את המתלים והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את התאים העצביים במאגר קר להמשך ניתוח.

כדי לטחון את הרקמה, אפשר לדגימות להפשיר על צלחת זכוכית קרה לא יותר מדקה אחת לפני כיסוי הדגימות בטיפה אחת עד שתיים של תמיסת חיץ A. לאחר מכן, אוחזים בסכין גילוח אנכי לחלוטין לצלחת, טוחנים את הרקמה 100 פעמים בכל כיוון אורתוגונלי. כדי לטחון היטב את הרקמה, חשוב לשמור על הרקמה רטובה עם מאגר A ולעקוב אחר זמני הטחינה והכיוון שצוינו.

זה קריטי להסיר את רוב החומר הלבן במהלך דיסקציה של הרקמה, ולשמור על הרקמה מכוסה במאגר A, כדי לשפר את יעילות הטחינה ולשמור על בריאות התאים.

לאחר עיבוד יסודי של הרקמה, השתמשו בסכין הגילוח כדי להעביר את החלקים לתוך צינור מיקרו-צנטריפוגה המכיל 1 מיליליטר של מאגר קר A, והפכו את הצינור שלוש עד חמש פעמים כדי להטביע את כל הרקמה הטחונה בתמיסה. כדי לפרק את שברי הרקמה לתרחיף תא בודד, גלולה את הדגימות על ידי צנטריפוגה.

השליכו את הסופרנטנט, ואז הוסיפו לאט 1 מיליליטר של תמיסת אנזים קרה ומופשרת טרייה במורד הדופן הפנימית של המיקרו-צינור והשתמשו בפיפטה בקוטר קצה גדול כדי לשאוב מיד ולהוציא את כל כל הכדור ארבע פעמים כדי לפזר את חתיכות הרקמה הטחונה. לאחר מכן, הפוך במהירות את המיקרו-צינור כדי למנוע מהכדורים להידבק לתחתית הצינור, ודגר את הדגימה בערבוב מקצה לקצה למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.

בתום העיכול, צנטריפוגה שוב את הצינור והוסף 0.6 מיליליטר חיץ קר A לתאים. בעזרת אותו קצה פיפטה, שאפו מיד והוציאו את הכדורים חמש פעמים, ולאחר מכן בחרו פיפטה מזכוכית בגודל 1.3 מילימטר, והשתמשו בה כדי לטטר בעדינות את הדגימות 10 פעמים.

הניחו את הדגימה על קרח למשך 2 דקות כדי לאפשר לפסולת ולתאים הלא מנותקים להתיישב בתחתית הצינור. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט לצינור חדש של 15 מיליליטר. לאחר מכן, העבירו 800 מיקרוליטר של תאים מהצינור הראשון של סופרנטנט שנאסף לכל אחד משני הצינורות הראשונים של אתנול.

הפוך את הצינורות כדי לערבב את הדגימות. לאחר מכן מניחים את הדגימות על קרח למשך 15 דקות עם ערבוב על ידי היפוך כל 5 דקות. בתום הדגירה יש לצנטריפוגה את התאים. לאחר מכן נגעו רק בדופן המיקרו-צינור, השתמשו במיקרופיפטה כדי להסיר לאט את כל 50 המיקרוליטרים האחרונים של כל סופרנטנט.