הערכת מצב הפלמיטוילציה של חלבוני קרום התא מרקמת מוח של עכבר

קח חלבוני קרום התא מרקמת מוח של עכבר.

חלבונים אלה מציגים שינוי לאחר התרגום עם קבוצות פלמיטויל, חומצת שומן, המחוברת לשאריות ציסטאין.

הוסף חיץ מפחית ודגר בטמפרטורה גבוהה כדי לשבור קשרים בין ציסטאין שאינו פלמיטוילט ולחשוף אותם.

דגירה עם מגיב חוסם שנקשר לציסטאין החשוף, ומשאיר רק את הציסטאין הפלמיטוילילט תגובתי.

העבירו את התמיסה, ערבבו אותה עם כלורופורם, מתנול ומים נטולי יונים, צנטריפוגה כדי לזרז את החלבונים והסירו זיהומים. לאחר מכן, הוסף מתנול, צנטריפוגה והשליך את כל המזהמים שנותרו.

הוסף חיץ, סוניקט כדי להמיס את הגלולה, ואז צנטריפוגה והסר חומרים בלתי מסיסים.

מרחו מגיב שסוע כדי להסיר את קבוצות הפלמיטואיל מהציסטאין הפלמיטוילטי.

חזור על משקעי כלורופורם-מתנול והסר כל זיהום.

דגירה עם פולימר שנקשר לציסטאין לא חסום, ועוזר לזהות את החלבונים הפלמיטוילטים.

חזור על משקעי כלורופורם-מתנול והסר את כל הפולימרים הלא קשורים.

השעו מחדש את הגלולה לניתוח נוסף של מצב הפלמיטוילציה של החלבונים המבודדים.

ראשית, לשבש את קשרי הדיסולפיד על ידי דגירה של החלבון המסיס ב-25 מיקרוליטר של TCEP, למשך 60 דקות ב-55 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חסמו ציסטאין חופשי על ידי דגירה של התמיסה עם 12.5 מיקרוליטר מתמיסת המלאי של NEM למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, התחל בתהליך של משקעי כלורופורם-מתנול. העבירו את תמיסת החלבון מצינור ה-1.5 מיליליטר לצינור פוליפרופילן או זכוכית שניתן לצנטריפוגה ברוטור דלי מתנדנד במהירות צנועה. מוסיפים 2 מיליליטר מתנול, ומערבולת קצרה. מוסיפים 1 מיליליטר כלורופורם, ומערבולת קצרה. לאחר מכן, הוסף 1.5 מיליליטר מים נטולי יונים ומערבולת לזמן קצר שוב.

במידת הצורך, הפוך את הצינור כדי להבטיח ערבוב יסודי. צנטריפוגה את הדגימות בטמפרטורה של 3,000 פעמים G ו-25 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ברוטור דלי מתנדנד. הסר בזהירות והשליך את השלב העליון של התמיסה בצינור. הוסף 1.5 מיליליטר מתנול. מערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך עדין של הצינור, נזהרים לא לפצל את פנקייק החלבון האטום.

צנטריפוגה של הדגימה בטמפרטורה של 3,000 פעמים G ו-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ברוטור דלי מתנדנד. בעזרת פיפטה סרולוגית מזכוכית, הסר כמה שיותר מהשלב העליון של התמיסה מבלי להפריע לפנקייק החלבון. שטפו בזהירות את הגלולה עם 1 מיליליטר מתנול, והניחו לה להתייבש באוויר למשך 10 דקות לפחות.

עם השלמת משקעי הכלורופורם-מתנול, התחל את המחשוף של קשרי הפלמיטויל תיואסטר על ידי השעיית משקעי החלבון ב-125 מיקרוליטר של מאגר A. העבירו לצינור חדש של 1.5 מיליליטר. סוניקציה קצרה של הצינורית, ולאחר מכן צנטריפוגה ב-13,000 פעמים G ומעלה ו-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות כדי להסיר חומר בלתי מסיס.

העבירו את החלבון המסיס לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר, והוסיפו 375 מיקרוליטר של מאגר H או מאגר T. לאחר דגירה של הדגימות במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר, חזור על משקעי הכלורופורם-מתנול. כדי להוסיף mPEG לציסטאין לא מוגן, התחל בהשעיית הגלולה ב-100 מיקרוליטר של מאגר A המכיל 10 מילי-מולרי TCEP.

לאחר מכן העבירו את המתלה לצינור של 1.5 מיליליטר. הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת mPEG 5k מלאי וערבב על ידי פיפטינג. דגירה בטמפרטורת החדר עם סיבוב מקצה לקצה. לאחר 60 דקות של דגירה, הסר mPEG 5k לא משולב על ידי ביצוע משקעי מתנול כלורופורם שוב.

צנטריפוגה בטמפרטורה של יותר מ-13,000 פעמים G ו-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הסר בזהירות את השלב העליון כמו קודם, הימנע מהפנקייק העבה והפלוקולנטי. מוסיפים 1 מיליליטר מתנול ומערבבים בעדינות אך ביסודיות. צנטריפוגה בטמפרטורה של יותר מ-13,000 פעמים G ו-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

הסר בזהירות את הסופרנטנט ושטוף את הגלולה עם 1 מיליליטר מתנול. שוב, צנטריפוגה בטמפרטורה של יותר מ-13,000 פעמים G ו-25 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר ייבוש הגלולה באוויר, מושעה מחדש ב-50 מיקרוליטר של מאגר A ללא TCEP או כל חומר מפחית.