הערכת מצב הפלמיטוילציה של חלבוני קרום התא מרקמת מוח של עכבר

קח חלבוני קרום התא מרקמת מוח של עכבר.

חלבונים אלה מציגים שינוי לאחר התרגום עם קבוצות פלמיטויל, חומצת שומן, המחוברת לשאריות ציסטאין.

הוסף חיץ מפחית ודגר בטמפרטורה גבוהה כדי לשבור קשרים בין ציסטאין שאינו פלמיטוילט ולחשוף אותם.

דגירה עם מגיב חוסם שנקשר לציסטאין החשוף, ומשאיר רק את הציסטאין הפלמיטוילילט תגובתי.

העבירו את התמיסה, ערבבו אותה עם כלורופורם, מתנול ומים נטולי יונים, צנטריפוגה כדי לזרז את החלבונים והסירו זיהומים. לאחר מכן, הוסף מתנול, צנטריפוגה והשליך את כל המזהמים שנותרו.

הוסף חיץ, סוניקט כדי להמיס את הגלולה, ואז צנטריפוגה והסר חומרים בלתי מסיסים.

מרחו מגיב שסוע כדי להסיר את קבוצות הפלמיטואיל מהציסטאין הפלמיטוילטי.

חזור על משקעי כלורופורם-מתנול והסר כל זיהום.

דגירה עם פולימר שנקשר לציסטאין לא חסום, ועוזר לזהות את החלבונים הפלמיטוילטים.

חזור על משקעי כלורופורם-מתנול והסר את כל הפולימרים הלא קשורים.

השעו מחדש את הגלולה לניתוח נוסף של מצב הפלמיטוילציה של החלבונים המבודדים.

ראשית, לשבש את קשרי הדיסולפיד על ידי דגירה של החלבון המסיס ב-25 מיקרוליטר של TCEP, למשך 60 דקות ב-55 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, חסמו ציסטאין חופשי על ידי דגירה של התמיסה עם 12.5 מיקרוליטר מתמיסת המלאי של NEM למשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, התחל בתהליך של משקעי כלורופורם-מתנול. העבירו את תמיסת החלבון מצי