אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 3:08 דק׳ • July 8th, 2025
קחו לדוגמה את דופן הגוף של זחלי דרוזופילה, המורכבים משרירים המופנים על ידי נוירונים מוטוריים ליצירת צמתים עצביים-שריריים או NMJs.
קרום השריר הפוסט-סינפטי ב-NMJ מכיל חלבונים הקשורים לממברנה, המסומנים בנוגדנים ראשוניים.
הוסף בדיקת קשירת קרבה, או PLA, בדיקות המכילות נוגדנים משניים מצומדים לאוליגונוקלאוטידים חד-גדיליים. דגירה כדי שהבדיקות ייקשרו לנוגדנים הראשוניים.
שטפו את כל הבדיקות הלא קשורות.
דגירה עם מאגר קשירה המכיל אוליגונוקלאוטידים מחברים ואנזימי ליגאז.
הקרבה של החלבונים האינטראקטיביים מקלה על קשירת מחברים לבדיקות. לאחר מכן ליגאז אוטם את הפערים, ויוצר DNA מעגלי.
שטוף את כל המחברים הלא קשורים.
דגירה עם תמיסת הגברה המכילה פולימראז, המגביר את ה- DNA המעגלי באמצעות הגברת מעגל מתגלגל.
בדיקות גלאים מתויגות פלואורופור בתמיסה מחסלות את ה-DNA המוגבר, ובעת עירור מייצרות אות פלואורסצנטי.
הרכיבו את דופן הגוף על שקופית כדי לדמיין אינטראקציות חלבון-חלבון המסומנות פלואורסצנטיות ב-NMJ.
כדי להתחיל בבדיקה, הוסף דילול של 1 עד 5 בנפח כולל של לפחות 200 מיקרוליטר של בדיקת PLA נגד עכבר מינוס וגם בדיקת PLA נגד ארנב פלוס ב-1% BSA לדפנות הגוף. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
לאחר השימוש במאגר כביסה A לשטיפת דפנות הגוף פעמיים למשך 5 דקות כל אחת, הוסף דילול של 1 עד 40 של ליגאז בתמיסת ליגאז.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים