קביעת יכולת אגירת הסידן של מיטוכונדריה מבודדת

הנח את המיטוכונדריה שבודדה מתאי נוירובלסטומה במאגר המכיל צבע פלואורסצנטי אטום לממברנה, קושר סידן.

דגירה כדי לאפשר למיטוכונדריה להתייצב במאגר.

מוסיפים חיץ המכיל סידן ודוגרים בניעור.

יוני הסידן נקשרים למולקולות הצבע, וגורמים לפלואורסצנטיות שלהן.

באמצעות ספקטרומטר פלואורסצנטי, עקוב אחר הקרינה של הצבע בזמן אמת.

כעת, הזרקו חוצץ המכיל סידן במרווחי זמן קבועים.

ריכוז הסידן המוגבר מקדם את ספיגת הסידן המיטוכונדריאלי, ומפחית את יוני הסידן החופשיים הזמינים להיקשר לצבע, מה שמביא לירידה בקרינה.

ברגע שהמיטוכונדריה מגיעים לקיבולת אחסון הסידן המקסימלית שלהם, תוספת סידן נוספת מפעילה את פתיחת נקבובית מעבר החדירות המיטוכונדריאלית (mPTP).

פתח נקבוביות זה משחרר סידן מהמיטוכונדריה לתוך המאגר, שם הוא נקשר לצבע וגורם לפלואורסצנטיות מוגברת.

קבע את כמות הסידן הכוללת הנדרשת כדי לגרום לפתיחת mPTP, המשקפת את יכולת אגירת הסידן המיטוכונדריאלית.

הכן את אמצעי האשלגן הכלורי והוסף את הצבע הפלואורסצנטי הירוק הקושר סידן לריכוז סופי של 0.5 מיקרומולר לפני הניסוי. כדי לקבוע את יכולת שימור הסידן המיטוכונדריאלי, העבירו תחילה 1 מיליליטר של מיטוכונדריה מבודדת במדיה של אשלגן כלורי המכילה 0.5 צבע פלואורסצנטי ירוק קושר סידן מיקרו-מולרי לכל באר של צלחת בת 6 בארות.

דגרו את המיטוכונדריה בצבע הפלואורסצנטי הירוק הקושר סידן בצלחת 6 הב