אימונוהיסטוכימיה של קטעי רקמת מוח של עכבר למיקוד נוירונים של דופמין

קח שקופית מצופה פולימר עם קטעי רקמת מוח של עכבר המכילים נוירונים של דופמין המבטאים טירוזין הידרוקסילאז, אנזים מפתח לסינתזה של דופמין.
מתאר את החלקים עם עט הידרופובי כדי להבטיח צביעה אחידה.
קבע את הרקמה בתמיסת אצטון-מתנול כדי לשמר את המורפולוגיה של הרקמות.
שטוף עם בופר המכיל חומר ניקוי כדי לחלחל את קרומי התאים.
דגירה עם נוגדנים ראשוניים המכוונים לטירוזין הידרוקסילאז בנוירונים של דופמין, ולאחר מכן שטפו כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.
הוסף נוגדנים משניים מתויגים בצבע פלואורסצנטי, צבע גרעיני ומעכבי RNase.
במהלך הדגירה, נוגדנים משניים נקשרים לנוגדנים ראשוניים, צבעים גרעיניים מסמנים את הגרעין, ומעכבי RNase משביתים RNases.
שטוף עם חוצץ. לאחר מכן, יבש את חלקי הרקמה בריכוזים הולכים וגדלים של אתנול.
דגירה בקסילן כדי לנקות את הרקמה.
קטעי הרקמה המעובדים מוכנים כעת ללכידת לייזר מיקרו-דיסקציה, המאפשרת הדמיה ודיסקציה מדויקת של נוירוני דופמין מטרה.

כדי לבצע אימונוהיסטוכימיה, השתמש בעט הידרופובי כדי לשרטט רקמות ולאפשר להן להתייבש. לאחר מכן, בתמיסת מתנול אצטון 1 עד 1, תקן את הרקמה בטמפרטורה שלילית של 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. לאחר הוצאת הרקמה מהמקפיא, מכסים את החלקים ב-100 עד 200 מיקרוליטר נוגדן טירוזין הידרוקסילאז ב-PBS ו-1% טריטון למשך 10 דקות.

לאחר מכן, השתמש ב-PBS עם 1% טריטון כדי לשטוף את השקופיות לפני כיסוי החלקים ב-100 עד 200 מיקרוליטר של IgG נגד ארנב עזים, המסומן ב-Alexa Fluor 488. דגרו במשך חמש דקות, ולאחר מכן השתמשו ב-PBS כדי לשטוף את השקופיות פעמיים. לאחר מכן, יש לייבש את הדגימות בסדרה מדורגת של אתנול נטול RNase למשך 30 שניות כל אחת, כפי שהודגם קודם לכן בסרטון זה. דגירה בקסילן, למשך דקה אחת ושטיפה שנייה, למשך חמש דקות. הסר את השקופיות מיד לפני השימוש ב-LCM ואפשר להן להתייבש באוויר.