חקר סחר בחלבוני ממברנה בתאי קולטני אור של דרוזופילה

קח זבוב כהה, מורדם, טרנסגני, בעל עיניים לבנות.

הזבוב מבטא תעלות יונים TRPL מתויגות eGFP בקולטני האור של העין.

בחושך, TRPL מתמקם בממברנות של הרבדומרים - המיקרוווילי של קולטני האור.

באמצעות אוויר דחוס, דחף את הזבוב עם הראש לתוך קצה פיפטה.

חתוך את הקצה ודחף את הזבוב לאחור.

חתוך אותו שוב ודחף את הזבוב קדימה עד שרק ראשו בולט.

לשתק את הקצה בחימר מודלים המודבק לשקופית והנח אותו על שלב מיקרוסקופ פלואורסצנטי, כאשר העין פונה לאובייקט המיקרוסקופ באופן רדיאלי.

הוסף טיפת מים לאובייקט, ואז הורד אותה עד שהיא נוגעת בעין.

צלם תמונות של קולטני האור.

מדוד את עוצמות הקרינה ברבדומרים, בגוף התא וברקע.

האר את הזבוב באור כתום כדי לגרום לטרנסלוקציה של TRPL לגוף התא.

חזור על מדידות ההדמיה והפלואורסצנטיות.

השווה את התמונות כדי לצפות בפלואורסצנציה מופחתת של רבדומרל לאחר תאורה, מה שמצביע על טרנסלוקציה של TRPL לגוף התא.

כדי להכין זבוב בווריאציה לא קטלנית, העבירו את הזבוב המורדם בקרח עם הראש לקצה פיפטה של 200 מיקרוליטר, ודחפו בזהירות את הזבוב לכיוון הקצה עם אוויר דחוס. לאחר מכן, בעזרת אזמל, חתכו את קצה הפיפטה ממש מול הראש. ובעזרת פינצטה, דחף בזהירות את הזבוב כמה מילימטרים לקצה הפיפטה.

חותכים שוב את קצה הפיפטה. ודחף את הזבוב לאחור לכיוון הקצה עם האוויר הדחוס, כך שרק ראש הזבוב בולט מקצה הפיפטה. לאחר הדבקת חתיכת פלסטלינה על מגלשת חפץ, לחץ לתוכה את קצה הפיפטה כך שהעין השמאלית או הימנית פונה כלפי מעלה. ודא שהעין מכוונת נכון מתחת למיקרוסקופ. לרכישת תמונות, בחר יעד טבילה במים.

במקרה של וריאציה לא קטלנית, השתמש בפיפטה במעבדה כדי להדביק טיפה גדולה של מים צוננים לחלק התחתון של מטרת הטבילה במים. הנח בזהירות את שקופית האובייקט עם הזבוב המוכן על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, הורד את מטרת הטבילה במים באופן ידני עד שהיא נוגעת בפני המים, או שעין הזבוב נוגעת בטיפה.

לאחר מכן, העבירו את נתיב האור לכיוון מצלמת המיקרוסקופ, וצרו תמונה חיה. התאם מחדש את המיקוד למצלמה והעריך את כיוון העין, בהתחשב בכך שהעין חייבת לפנות לאובייקט המיקרוסקופ בצורה רדיאלית. השתמש בתוכנת טבלת בדיקת המידע כדי לזהות רוויית יתר.

במקרה של זבובים ללא פיגמנט, התאם את זמן החשיפה כך שהפיקסלים הבהירים ביותר יהיו ממש מתחת למגבלת הרוויה עבור כל תמונה. הקלט תמונה ושמור אותה כקובץ גולמי כדי לאחסן בארכיון את כל המטא נתונים המתאימים של ההקלטה. לאחר מכן, ייצא את התמונה בתבנית TIFF נקודה.

כדי לכמת את הקרינה היחסית של EGFP ברבדומרים של מיקרוגרפים טבולים במים, התאם את הגדרות ImageJ על ידי לחיצה על ניתוח. לאחר מכן, הגדר מידות וסמן רק את התיבה עבור ערך אפור ממוצע. ייבא את תמונת הנקודה TIFF על ידי לחיצה על קובץ ולאחר מכן על פתח. בחרו אזור מייצג של התמונה שנמצא במוקד, והגדילו אותו ל- 200% עד 300% בלחיצה חוזרת ונשנית על Control ו- Plus יחד.

לאחר מכן, בחר את הכלי אליפסה. ותוך כדי לחיצה על מקש Shift, צור בחירה מעגלית בתמונה הקטנה משמעותית מרבדומר פלואורסצנטי אחד. לאחר מכן, חפש את הגודל המדויק המוצג מתחת לסרגל הכלים בחלון הראשי של ImageJ. כדי למדוד את עוצמות הקרינה בתוך הבחירה המעגלית, הזז את העיגול לרבדומר הראשון עם מקשי החצים בלוח המקשים, לחץ על נתח ולאחר מכן מדוד.

יופיע חלון תוצאות המפרט את הערך האפור הנמדד. המשיכו במדידות של רבדומרים 2 עד 6, ומדדו גם את אות הרקע. במקרה של זבובים ללא פיגמנט, בצע מדידות נוספות של אזורי גוף התא המתאימים. מדוד את הקרינה של שתי אומטידיות נוספות, וכתוצאה מכך שלושה שכפולים טכניים. סמן את האומטידיה המנותחת באמצעות כלי העיפרון ושמור תמונה זו לתיעוד.

בחר והעתק את ערכי האפור הנמדדים מחלון התוצאות והדבק אותם בתוכנת גיליון אלקטרוני לצורך חישובים נוספים. מיין את ערכי עוצמת הקרינה לפי מקורם לרבדומר, גוף התא והרקע של הקטגוריה, וחשב את העוצמה הממוצעת מכל קטגוריה. לאחר מכן חשב את הכמות היחסית של EGFP הקיימת ברבדומר, באמצעות הנוסחה הראשונה לעיניים ללא פיגמנט, והשנייה לעיניים פיגמנטיות.