איתור שינויים בהיסטון בתאי שמרים עם ביטוי יתר של חלבון ניווני

התחל בהשעיה של תאי שמרים המבטאים יתר על המידה חלבונים הקשורים למחלות ניווניות.

חלבון זה אחראי לשינויים בחלבוני אריזת ה-DNA או בהיסטונים עם חלקים כימיים.

הוסף נתרן הידרוקסיד ובטא-מרקפטואתנול ולאחר מכן דגר על קרח.

נתרן הידרוקסיד ובטא-מרקפטואתנול מפרקים את התאים, ומשחררים את החלבונים התוך-תאיים, כולל היסטונים.

צנטריפוגה של הליזאט כדי לאסוף את החלבונים. השליכו את הסופרנטנט.

הוסף צבע טעינה לכדור החלבון וחמם אותו כדי לנטרל אותם.

טען את החלבונים המפורקים הללו וסמן חלבון על הג'ל והאלקטרופורזה כדי להפריד ביניהם לפי גודל.

מעבירים את החלבונים על קרום, שוטפים ומוסיפים מאגר חוסם כדי למנוע קשירה לא ספציפית.

הוסף נוגדנים ראשוניים הנקשרים באופן ספציפי להיסטונים ששונו.

שטפו כדי להסיר נוגדנים לא קשורים ולדגור עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.

פס פלואורסצנטי מובהק מאשר שינויים בהיסטון, המעיד על ביטוי יתר של חלבונים ניווניים.

כדי להפשיר את התאים לניתוח כתמים מערביים, יש להפשיר את כדורי תאי השמרים על קרח לפני השעיה מחדש ב-100 מיקרוליטר מים מזוקקים. הוסף 300 מיקרוליטר של 0.2 נתרן הידרוקסיד מולרי, ו-20 מיקרוליטר של 2-Mercaptoethanol לכל דגימת תא. ולהשעות את הכדורים על ידי פיפטינג.

לאחר דגירה של 10 דקות על קרח, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה, והשעיה מחדש את הדגימות ב-100 מיקרוליטר של צבע טעינה. לאחר מכן הרתיחו את הדגימות למשך 10 דקות על גוש חימום. בזמן שהדגימות עוברות ליזה, הניחו שני ג'לים במחזיק ג'ל, ומלאו את החדר הפנימי למעלה במאגר רץ ואת החדר החיצוני לסימון קו שני הג'לים.

כאשר הדגימות מוכנות, טען 15 מיקרוליטר כל תמיסת ליזה של תאים לכל באר של ג'ל פוליאקרילאמיד 10 בארות 12% והוסף 5 מיקרוליטר של סולם חלבון לבאר נתיב סולם החלבון. הפעל את הג'ל למשך כ-45 דקות ב-150 וולט או עד שחזית הצבע מגיעה לתחתית הג'ל.

בזמן שהג'ל פועל, יש להשרות שתי רפידות סיבים לכל ג'ל במאגר העברה, וממברנת פוליווינילידן פלואוריד או PVDF אחת לכל ג'ל במתנול. כשהג'ל מוכן, יש לשטוף את הממברנה ולהעביר את המאגר. והניחו כרית סיבים ספוגה מראש בתחתית תא מכשיר העברה יבש למחצה, ואחריה קרום ה-PVDF, הג'ל וכרית הסיבים השנייה שהושרה מראש.

לאחר מכן הגדר את ההספק ל -150 מיליאמפר למשך שעה. בתום העברת החלבון, הסר את הממברנה ממנגנון ההעברה לשטיפה קצרה במים מזוקקים. הניחו את צד חלבון הממברנה השטוף כלפי מעלה בקופסת צביעה קטנה, וכסו את הממברנה במי מלח עם Tris-buffered או TBS Buffer למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.

בתום הדגירה החוסמת, יש לדגור את הממברנה למשך הלילה עם היסטון נגד שמרים ולשנות נוגדן ספציפי ב-TBS ב-4 מעלות צלזיוס, ונוגדנים מתאימים לבקרת עומס גרעיני.

למחרת בבוקר יש לשטוף את הממברנה ארבע פעמים ב- TBS, בתוספת 0.1% פוליסורבט 20 למשך חמש דקות עם נדנדה בטמפרטורת החדר לכל שטיפה. לאחר השטיפה האחרונה, דגרו את הכתם עם הנוגדנים המשניים המתאימים למשך שעה בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן ארבע שטיפות של 5 דקות ב-TBST ושטיפה אחת של חמש דקות ב-TBS בלבד עם נדנדה.

לאחר מכן דמיין את הכתם במערכת הדמיית כתם מערבי פלואורסצנטי למשך 2 דקות.