איתור שינויים בהיסטון בתאי שמרים עם ביטוי יתר של חלבון ניווני

התחל בהשעיה של תאי שמרים המבטאים יתר על המידה חלבונים הקשורים למחלות ניווניות.

חלבון זה אחראי לשינויים בחלבוני אריזת ה-DNA או בהיסטונים עם חלקים כימיים.

הוסף נתרן הידרוקסיד ובטא-מרקפטואתנול ולאחר מכן דגר על קרח.

נתרן הידרוקסיד ובטא-מרקפטואתנול מפרקים את התאים, ומשחררים את החלבונים התוך-תאיים, כולל היסטונים.

צנטריפוגה של הליזאט כדי לאסוף את החלבונים. השליכו את הסופרנטנט.

הוסף צבע טעינה לכדור החלבון וחמם אותו כדי לנטרל אותם.

טען את החלבונים המפורקים הללו וסמן חלבון על הג'ל והאלקטרופורזה כדי להפריד ביניהם לפי גודל.

מעבירים את החלבונים על קרום, שוטפים ומוסיפים מאגר חוסם כדי למנוע קשירה לא ספציפית.

הוסף נוגדנים ראשוניים הנקשרים באופן ספציפי להיסטונים ששונו.

שטפו כדי להסיר נוגדנים לא קשורים ולדגור עם נוגדנים משניים פלואורסצנטיים, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.

פס פלואורסצנטי מובהק מאשר שינויים בהיסטון, המעיד על ביטוי יתר של חלבונים ניווניים.

כדי להפשיר את התאים לניתוח כתמים מערביים, יש להפשיר את כדורי תאי השמרים על קרח לפני השעיה מחדש ב-100 מיקרוליטר מים מזוקקים. הוסף 300 מיקרוליטר של 0.2 נתרן הידרוקסיד מולרי, ו-20 מיקרוליטר של 2-Mercaptoethanol לכל דגימת תא. ולהשעות את הכדורים על ידי פיפטינג.

לאחר דגירה של 10 דקות על קרח, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה, והשעיה מחדש את הדגימות ב-100 מיקרוליטר של צבע