איתור חלבון הקשור למחלות נוירודגנרטיביות α-Synuclein באמצעות ELISA
אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 4:37 דק׳ • April 28th, 2025
נתחיל ברקמת המוח של עכבר טרנסגני המבטא יתר על המידה α-synuclein, חלבון עצבי מקופל בצורה לא נכונה הקשור למחלות ניווניות, שקוע במאגר עתיר מלח.
הומוגניזציה של הרקמה עם עלי גדול, ואחריו עלי קטן כדי לשבש את הרקמה ולשחרר חלבונים תוך תאיים, כולל α-synuclein.
מעבירים את ההומוגנאט לצינור ולצנטריפוגה. אספו את הסופרנטנט המכיל חלבון ודללו אותו בעזרת חוצץ.
הוסף את הסופרנטנט הזה למיקרו-פלטת מצופה נוגדנים ספציפיים לנוגדנים α-סינוקלאין שטופלה מראש בחומר חוסם כדי למנוע קשירה לא ספציפית.
לדגור עם תסיסה, מה שמאפשר ל-α-synuclein נורמלי ומוטנטי להיקשר.
שטפו את הצלחת, ואז הוסיפו נוגדנים לזיהוי ספציפיים ל-α-synuclein שעבר מוטציה ודגרו עם תסיסה.
יש לשטוף שוב ולהוסיף נוגדנים הקשורים לאנזים, ולאחר מכן דגירה תחת תסיסה.
מוסיפים מצע ודוגרים בחושך תחת תסיסה. המצע מגיב עם האנזים כדי לייצר שינוי צבע.
עצור את התגובה עם חומצה ומדוד את הספיגה כדי לכמת α-synuclein מוטנטי.
כדי להכין הומוגנטים במוח, הוסף נפח מספיק של מאגר HS לאזורי המוח המנותחים כדי להגיע לאחוז הומוגנטי הצפוי, כפי שמוצג בטבלה למטה. בעזרת מטחנת רקמות המורכבת מצינור זכוכית בורוסיליקט ושני עליים, A ו-B, יוצקים אזור במוח לריסוק לתוך הצינור. ואז עם עלי A, הומוגניזציה של הרקמה 10 פעמים כדי לנתק אותה.
לאחר מכן, עברו לעלי B והומוגניזציה 20 פעמים נוספות. בעזרת פיפטת העב
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים