איתור חלבון הקשור למחלות נוירודגנרטיביות α-Synuclein באמצעות ELISA

נתחיל ברקמת המוח של עכבר טרנסגני המבטא יתר על המידה α-synuclein, חלבון עצבי מקופל בצורה לא נכונה הקשור למחלות ניווניות, שקוע במאגר עתיר מלח.

הומוגניזציה של הרקמה עם עלי גדול, ואחריו עלי קטן כדי לשבש את הרקמה ולשחרר חלבונים תוך תאיים, כולל α-synuclein.

מעבירים את ההומוגנאט לצינור ולצנטריפוגה. אספו את הסופרנטנט המכיל חלבון ודללו אותו בעזרת חוצץ.

הוסף את הסופרנטנט הזה למיקרו-פלטת מצופה נוגדנים ספציפיים לנוגדנים α-סינוקלאין שטופלה מראש בחומר חוסם כדי למנוע קשירה לא ספציפית.

לדגור עם תסיסה, מה שמאפשר ל-α-synuclein נורמלי ומוטנטי להיקשר.

שטפו את הצלחת, ואז הוסיפו נוגדנים לזיהוי ספציפיים ל-α-synuclein שעבר מוטציה ודגרו עם תסיסה.

יש לשטוף שוב ולהוסיף נוגדנים הקשורים לאנזים, ולאחר מכן דגירה תחת תסיסה.

מוסיפים מצע ודוגרים בחושך תחת תסיסה. המצע מגיב עם האנזים כדי לייצר שינוי צבע.

עצור את התגובה עם חומצה ומדוד את הספיגה כדי לכמת α-synuclein מוטנטי.

כדי להכין הומוגנטים במוח, הוסף נפח מספיק של מאגר HS לאזורי המוח המנותחים כדי להגיע לאחוז הומוגנטי הצפוי, כפי שמוצג בטבלה למטה. בעזרת מטחנת רקמות המורכבת מצינור זכוכית בורוסיליקט ושני עליים, A ו-B, יוצקים אזור במוח לריסוק לתוך הצינור. ואז עם עלי A, הומוגניזציה של הרקמה 10 פעמים כדי לנתק אותה.

לאחר מכן, עברו לעלי B והומוגניזציה 20 פעמים נוספות. בעזרת פיפטת העברה, העבירו את ההומוגנאט לצינור של 1.5 מיליליטר, וחזרו על ההומוגניזציה עם דגימות המוח הנותרות. צנטריפוגה את הדגימות ב-1,000 גרם למשך חמש דקות, בארבע מעלות צלזיוס. ואז אוספים את הסופרנטנטים ומחלקים אותם ל-200 מיקרוליטר אליקוטים.

עם 100 מיקרוליטר של תמיסת ציפוי הנוגדנים, מצפים את הבארות של 96 מיקרו-פלטות באר ודוגרים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. למחרת, הוסיפו 300 מיקרוליטר PBST לבארות, והשתמשו במכונת כביסה כדי לשטוף את הצלחות חמש פעמים. תוך כדי עבודה בטמפרטורת החדר, קדימה, הוסף 200 מיקרוליטר של מאגר חוסם T20 PBS לכל באר, ונער את הצלחות ב-150 סל"ד למשך שעה לפני השימוש ב-PBST לשטיפת הצלחות חמש פעמים.

באמצעות PBST, 1% מה-BSA, מדללים את המוח ההומוגני באמצעות ההנחיות המפורטות כאן. ולהוסיף 100 מיקרוליטר לכל באר. לאחר מכן יש לדגור בטמפרטורת החדר וב -150 סל"ד למשך שעתיים לפני השימוש ב- PBST כדי לשטוף את הצלחות חמש פעמים.

לאחר השטיפה הסופית, הוסף את הנוגדנים הדרושים לזיהוי אלפא סינוקלאין מדוללים ב-PBST ו-1% BSA כמפורט בטבלה השנייה של פרוטוקול הטקסט. דגירה בטמפרטורת החדר ו -150 סל"ד למשך שעה לפני שטיפת הצלחות חמש פעמים כמו קודם.

לאחר מכן, הוסף מצומדי IGG HRP נגד עכבר או נגד ארנב מדולל ל-1 עד 8,000 ב-PBST, 1% BSA. ודגירה בטמפרטורה של 150 סל"ד למשך שעה לפני שטיפת הצלחות חמש פעמים. לאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת TMB לכל באר, ודגרו ב-150 סל"ד למשך 15 דקות בחושך. עצור את התגובה על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של חומצה הידרוכלורית רגילה אחת לכל באר. לאחר מכן, השתמש בקורא מיקרו-פלטות כדי למדוד את הספיגה ב-450 ננומטר.