אפיון ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק באמצעות אימונופלואורסצנציה

קח ספרואידים של גידול נוירואנדוקריני במעי הדק בצינור.

הוסף פתרון מקבע לשימור התאים.

כדי לשטוף, לצנטריפוגה ולהחליף את הקיבוע במאגר.

צנטריפוגה והשליכו את ה-supernatant כדי להסיר את כל הקיבוע שנותר.

הוסף חוצץ המכיל חומר ניקוי וחומר חוסם כדי לחדור לממברנות התאים ולמנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר עודפי חומר ניקוי וחומר חוסם.

דגירה עם נוגדנים ראשוניים, הנקשרים לחלבון המטרה הספציפי לתא הנוירואנדוקריני.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הוסף נוגדנים משניים מתויגים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר עודפי נוגדנים.

הוסף מדיום הרכבה המכיל צבע כדי להכתים את הגרעין.

העבירו את הספרואידים לשקופית והרכיבו עם פתק כיסוי.

השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לדמיין תאים נוירואנדוקריניים של הספרואיד המבטאים חלבונים ספציפיים.

תקן את האורגנואידים על ידי הוספת 500 מיקרוליטר של פרפורמלדהיד ודגירה שלהם למשך 15 דקות. לאחר הדגירה יש לשטוף את התרבות פעמיים עם 1 מיליליטר PBS. הוסף 500 מיקרוליטר PBS עם 3% BSA ו-0.1% טריטון X-100 כדי לחלחל את התרבית. דגרו את הצינור למשך חמש דקות, ולאחר מכן שטפו את האורגנואידים שלוש פעמים עם 1 מיליליטר PBS ו-3% BSA.

לאחר מכן, דגרו על התרבית עם נוגדנים ראשוניים למשך שעה, ולאחר מכן חזרו על השטיפות עם PBS ו-BSA. דגרו עם הנוגדנים המשניים וחזרו על השטיפות, הקפידו לשאוב ולהשליך את כל הסופרנטנט.

כדי לדמות את הספרואידים, הוסף 5 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה המכיל DAPI, והשתמש בפיפטה P20 כדי להעביר 5 מיקרוליטר של הספרואידים לשקופית זכוכית. אטום את השקופית עם פתק כיסוי, וצלם עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות המטרות פי 10, 20 ו-40.