זיהוי טרנספורטר אשלגן-כלוריד עצבי זרחני 2 באמצעות Western Blotting

קח ליזאט תא המכיל אשלגן-כלוריד קוטרנספורטר 2, או חלבוני KCC2, המווסתים את רמות הכלוריד העצבי

זרחון באתרים רגולטוריים משבש את תפקוד KCC2, ומווסת את הפעילות העצבית.

הוסף את הליזט לחרוזים מצומדים עם נוגדנים המכוונים ל-KCC2 זרחני. יש לדגור כדי לאפשר קשירה, ולאחר מכן לשטוף כדי להסיר חלבונים לא קשורים ופסולת תאית.

טפל עם מאגר דנטורציה בטמפרטורה גבוהה כדי לשחרר KCC2, ואז צנטריפוגה כדי להפריד את החרוזים.

טען את הסופרנטנט המכיל KCC2 על ג'ל אלקטרופורזה. הפרד את החלבונים לרצועות כדי לאשר את נוכחותו של KCC2 זרחני.

העבירו את הרצועות לממברנה, ולאחר מכן דגרו בתמיסת חסימה כדי להסוות אתרי קשירה לא ספציפיים.

דגירה עם נוגדנים ראשוניים המכוונים ל-KCC2 זרחני.

שטפו, ולאחר מכן דגרו עם נוגדנים משניים מתויגים באנזים כדי לסמן את הנוגדנים העיקריים.

שטפו שוב, ולאחר מכן הוסיפו מצע כימילומינסנצינטי, המגיב עם האנזים להפקת אור.

מדוד את עוצמת האור כדי לכמת KCC2 זרחני בליזאט.

פיפטה 300 מיקרוליטר של חלבון G sepharose לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, צנטריפוגה את התמיסה ב -500 גרם למשך שתי דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסיפו 500 מיקרוליטר PBS ומערבולת היטב. השליכו את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה, וחזרו על שלב זה.

לאחר מכן, ערבבו 1 מיליגרם של נוגדנים נגד KCC2 threonine 906 ואנטי-KCC2 threonine 1007 עם 200 מיקרוליטר של חרוזי ספרוז חלבון G, לפני שתשלימו את הנפח ל-500 מיקרוליטר עם PBS. לאחר טלטול על פלטפורמה רוטטת, או סיבוב גלגל במשך שעתיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, חזור על שתי שטיפות עם PBS.

בצע כימות חלבון על הליזטים של התא, והוסף 1 מיליגרם של ליזאט התא לחרוזים השטופים ודגר במסובב מקצה לקצה לפני הסיבוב למטה. תן שלוש שטיפות עם PBS המכיל 150 מילי-מולרי נתרן כלורי, ולאחר מכן שלוש שטיפות עם 200 מיקרוליטר PBS לפני השעיית הגלולה הסופית ב-100 מיקרוליטר של מאגר דגימת LDS.

נער את הצינורות בשייקר רוטור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. דגרו אותם בבלוק חימום, וצנטריפוגה לפני השימוש בסופרנטנט להעמסת ג'ל. הרכיבו את מנגנון יציקת הכתם המערבי ושפכו ג'ל הפרדה טרי של 8% כדי ליצוק את הג'ל, מה שמאפשר כ-2 סנטימטרים של מקום מהחלק העליון של זכוכית היציקה. הוסף 200 מיקרוליטר של איזופרופנול מוחלט להתקנה, ואפשר לו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות.

הסר את האיזופרופנול באמצעות פיפטה, ושטוף בזהירות את הג'ל בכ-200 מיקרוליטר מים מזוקקים. לאחר הוספת ג'ל ערימה טרי של 6% למערך היציקה, הכניסו בעדינות למסרק הבאר והניחו לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. לאחר מכן, תקן את הג'ל היצוק למיכל האלקטרופורזה.

לאחר שפיכת המאגר הפועל לתוך המיכל, טען 5 מיקרוליטר של סמן משקל מולקולרי לבאר הראשונה, וכמות שווה של חלבון לכל באר של ג'ל SDS-PAGE. מלאו את הבארות הריקות ב-LDS, והפעילו את הג'ל במשך כ-90 עד 120 דקות ב-120 וולט. החזר את קרום הניטרוצלולוזה עם מאגר העברה המכיל 20% מתנול.

שטפו את הג'ל והממברנה עם מאגר ההעברה, ופזרו אותם בעדינות על ערימת ההכנה. מסדרים את הכריך להעברה בסדר זה, אלקטרודה שלילית, קצף כריך, נייר פילטר, ג'ל SDS-PAGE שטוף, קרום ניטרוצלולוזה שטוף, נייר פילטר, קצף כריך, אלקטרודה חיובית. לאחר שתסיים, ערמו את הכריך המורכב במיכל ההעברה והפעילו ב-90 וולט למשך 90 דקות, או 30 וולט למשך 360 דקות.

חסום את הממברנה היבשה למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר באמצעות מאגר חוסם. דגרו את הממברנות עם דילולים מתאימים של נוגדנים ראשוניים ובטא אקטין במאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר או לילה ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, תן שלוש שטיפות של TBST למשך 5 דקות כל אחת.

יש לדגור על הממברנה השטופה עם נוגדן משני מדולל במאגר חוסם למשך 60 דקות, ולחזור על שלוש שטיפות של TBST. לאחר שתסיים, הנח את הממברנה השטופה על לוח ההדמיה. כדי לפתח את האותות, יש לפזר את התמיסה שהוכנה על ידי ערבוב נפחים שווים של כל מגיב כימילומינסנציה משופר על הממברנה, לפני העברת לוח ההדמיה למערכת ההדמיה לצורך הדמיה.