אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 5:25 דק׳ • April 28th, 2025
קח ליזאט תא המכיל אשלגן-כלוריד קוטרנספורטר 2, או חלבוני KCC2, המווסתים את רמות הכלוריד העצבי
.זרחון באתרים רגולטוריים משבש את תפקוד KCC2, ומווסת את הפעילות העצבית.
הוסף את הליזט לחרוזים מצומדים עם נוגדנים המכוונים ל-KCC2 זרחני. יש לדגור כדי לאפשר קשירה, ולאחר מכן לשטוף כדי להסיר חלבונים לא קשורים ופסולת תאית.
טפל עם מאגר דנטורציה בטמפרטורה גבוהה כדי לשחרר KCC2, ואז צנטריפוגה כדי להפריד את החרוזים.
טען את הסופרנטנט המכיל KCC2 על ג'ל אלקטרופורזה. הפרד את החלבונים לרצועות כדי לאשר את נוכחותו של KCC2 זרחני.
העבירו את הרצועות לממברנה, ולאחר מכן דגרו בתמיסת חסימה כדי להסוות אתרי קשירה לא ספציפיים.
דגירה עם נוגדנים ראשוניים המכוונים ל-KCC2 זרחני.
שטפו, ולאחר מכן דגרו עם נוגדנים משניים מתויגים באנזים כדי לסמן את הנוגדנים העיקריים.
שטפו שוב, ולאחר מכן הוסיפו מצע כימילומינסנצינטי, המגיב עם האנזים להפקת אור.
מדוד את עוצמת האור כדי לכמת KCC2 זרחני בליזאט.
פיפטה 300 מיקרוליטר של חלבון G sepharose לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה. לאחר מכן, צנטריפוגה את התמיסה ב -500 גרם למשך שתי דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, הוסיפו 500 מיקרוליטר PBS ומערבולת היטב. השליכו את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה, וחזרו על שלב זה.
לאחר מכן, ערבבו 1 מיליגרם של נוגדנים נגד KCC2 threonine 906 ואנטי-KCC2 threonine 1007 עם 200 מיקרוליטר של חרוזי ס
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים