כימות סומות תאי גנגליון ברשתית בעקבות יתר לחץ דם עיני המושרה על ידי צריבה

קח רשתית קבועה כימית שבודדה מעין של חולדה.

העין מציגה נזק הנגרם מחום למקלעת כלי הדם הלימבלית, רשת כלי דם המקיפה את הקרנית.

נזק זה חוסם את ניקוז הנוזלים, מגביר את הלחץ התוך עיני (IOP) וגורם לניוון תאי גנגליון ברשתית (RGC).

טפל ברשתית בתמיסת חדירה כדי לחלחל את התא ואת ממברנות הגרעין.

החל תמיסת חסימה כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפית.

הסר את פתרון החסימה.

הציגו נוגדנים ראשוניים המכוונים לגורם שעתוק המתבטא בעיקר ב-RGCs.

שטפו כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הציגו נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.

שטפו כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

צבע נגד הגרעינים בצבע קושר DNA.

שטפו את הרשתית והרכיבו אותה על מגלשת זכוכית באמצעות אמצעי הרכבה מתאים.

דמיין את הרשתית תחת מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.

צפיפות תאים מופחתת בעין הפגועה בהשוואה לבקרה מאשרת ניוון RGC עקב עלייה ב-IOP.

לאחר בידוד הרשתית, העבירו אותן לתוך צלחת תרבית של 24 בארות המכילה 1 מיליליטר PBS, תוך שמירה על הרשתית הפנימית כלפי מעלה. לחלחל את הרקמה על ידי שטיפה עם חומר פעילי שטח לא יוני 0.5% מדולל ב-PBS. לאחר מכן, דגרו את הרקמה בתמיסה חוסמת למשך שעה בטמפרטורת החדר עם ניעור עדין. במהלך הדגירה יש להכין תמיסת נוגדנים ראשונית BRM 3A ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

לאחר חסימת רקמות, יש לדגור על הרשתית ב-200 מיקרוליטר של תמיסת נוגדנים ראשונית ב-4 מעלות צלזיוס למשך 72 שעות עם ניעור עדין. לאחר מכן, שטפו את הטישו עם PBS. דגרו את הרקמה ב-200 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים המשנית למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן עם תמיסת כתמים גרעיניים גרעינית למשך 10 דקות לצביעה של גרעינים פלואורסצנטיים.

לאחר שלוש שטיפות PBS, העבירו את הרשתית לשקופית מיקרוסקופ זכוכית באמצעות שתי מברשות קטנות, תוך שמירה על הצד הזגוגי כלפי מעלה. מקם את רביע הרשתית הגבי כלפי מעלה על שקופית המיקרוסקופ. לבסוף, החל 200 מיקרוליטר של אמצעי הרכבה נגד דהייה על כיסוי זכוכית והנח אותו על הרשתית המותקנת השטוחה לניתוח מיקרוסקופי. תחת מיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי קונפוקלי המשתמש במטרה מגדלת פי 40, בחן את התושבות השטוחות כדי להעריך את תאי הגנגליון ברשתית.