תיוג חיסוני של חלבוני ממברנה עצבית בדגימה שסועה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר

קח דגימה שבורה בהקפאה של רקמת מוח של עכבר במאגר.

הדגימה מצופה בפלטינה כדי לשפר את פרטי פני השטח ובפחמן ליציבות מבנית.

העבירו את הדגימה לבקבוקון עם מאגר עיכול המכיל חומר ניקוי.

דגירה כדי להקל על פירוק הרקמות, ולהשאיר את הממברנה והחלבונים המוטבעים בציפוי.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר פסולת.

הוסף תמיסת חסימה כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפית.

הציגו נוגדנים ראשוניים ספציפיים לחלבון הממברנה העצבית המטרה.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים זהב הנקשרים לנוגדנים ראשוניים.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר עודפי נוגדנים.

יש לשטוף במים כדי למנוע שאריות מלח במהלך המיקרוסקופיה.

הרכיב את הדגימה על מיקרוסקופ אלקטרונים שידור או רשת TEM.

תחת ה-TEM, דמיין את חלבון הממברנה העצבית המטרה המזוהה על ידי חלקיקי זהב, המופיעים כנקודות שחורות.

לעיכול SDS, העבירו העתק לבקבוקון זכוכית של 4 מיליליטר מלא ב-1 מיליליטר של מאגר עיכול SDS. הניחו לו להתעכל במשך 18 שעות בחום של 80 מעלות צלזיוס עם ניעור. לתיוג חיסוני, שטפו את ההעתק במשך 10 דקות במאגר עיכול SDS טרי. לאחר מכן, דגרו אותו עם נוגדנים ראשוניים ומשניים מדוללים ב-2% BSA TBS בתא לח ב-15 מעלות צלזיוס למשך 24 עד 72 שעות.

לאחר מכן, הרכיב את העותק העתק על רשת מוטות מקבילים מצופה פורמבר, בת 100 שורות. דמיין את ההעתק עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב-80 או 100 קילו-וולט. לאחר מכן רכוש את התמונות הדיגיטליות באמצעות מצלמת CCD.