כרומטין מקורי אימונו-משקעים של תאי נוירוספרה

קח תאי נוירוספרה במאגר המכיל חומרי ניקוי, סידן ומעכבי פרוטאז.

חומר הניקוי מחלחל לתאים, בעוד שהמעכב מנטרל פרוטאזות כדי לשמר את חלבון המטרה הקשור לכרומטין.

מוסיפים נוקלאז ודוגרים. הנוקלאז משתמש בסידן כדי לעכל את הכרומטין.

הוסף מאגר המכיל EDTA שמכיל סידן, ומנטרל את הנוקלאז.

הוסף מאגר ליזה כדי ליז את התאים, ולשחרר את הכרומטין.

צנטריפוגה ולאסוף את הסופרנטנט.

הוסיפו נוגדנים ספציפיים לחלבון המטרה ודגרו בסיבוב. צנטריפוגה והסר את הסופרנטנט.

הכניסו חרוזים מגנטיים המכוונים לנוגדנים ודגרו בסיבוב.

הוסף מאגר ליזה כדי להפריד DNA שאינו קשור במיוחד.

לכוד את החרוזים באופן מגנטי והסר את הסופרנטנט.

הוסף חוצץ עתיר מלח כדי להפריד חלבונים שאינם קשורים ספציפית.

לכוד את החרוזים באופן מגנטי והסר את הסופרנטנט.

הוסף מאגר ייצוב, לכוד מגנטית את החרוזים והסר את המזהמים.

השעו מחדש במאגר חלבון-K כדי לעכל את החלבונים, ולשחרר את ה-DNA.

לאחר איסוף הנוירוספרות, צנטריפוגה 1 כפול 10 ל-6 תאי הנוירוספרה לכל משקעים חיסוניים ב-300 פעמים g למשך 5 דקות. לאחר הצנטריפוגה, שפכו את הסופרנטנט ותלו מחדש את כדור הנוירוספירה במיליליטר אחד של תמיסת מלח מאוזנת. העבירו את התרחיף לצינורות מיקרו-צנטריפוגה נמוכים של 1.5 מיליליטר ואז צנטריפוגה כמו קודם.

לאחר מכן, יש לשפוך את ה-supernatant ולהשעות מחדש את כדור התא ב-95 מיקרוליטר של מאגר עיכול בתוספת 1 עד 100 עם קוקטייל מעכב פרוטאז לכל 1 כפול 10 ל-6 תאים. פיפטה מיד את התאים למעלה ולמטה כדי למנוע גושים ולהימנע מיצירת בועות. לאחר מכן מערבבים 5 מיקרוליטרים של נוקלאז מיקרוקוקלי 0.1x ו-145 מיקרוליטר של מאגר עיכול, ומוסיפים 5 מיקרוליטר של נוקלאז מיקרוקוקלי מדולל לכל 1 כפול 10 ל-6 התאים. יש לערבב את השפופרת ולהניח את השפופרת בגוש חום של 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות בדיוק.

עיכול הנוקלאז המיקרוקוקלי לפיצול כרומטין הוא השלב הקריטי ביותר. פיצול כרומטין נכון חשוב להשגת רזולוציה גבוהה עבור ChIP. כדי להבטיח ששלב זה יצליח, דגרו מספר דגימות אחת בכל פעם כדי להבטיח שלא יתרחש עיכול יתר.

לאחר 12 דקות, הוסף 10 מיקרוליטר של 10x micrococcal nuclease stop buffer לכל 1 כפול 10 ל-6 התאים. יש לשמור דגימות על קרח מנקודה זו ואילך. ניתוח ביו-אנלייזר של הדגימה המעוכלת של נוקלאז מיקרוקוקלי מדגים שרוב ה-DNA פוצל למונו, די וטרי-נוקלאוזומים. לאחר מכן, הוסף 110 מיקרוליטר של מאגר RIPA 2x בתוספת 1 עד 100 עם קוקטייל מעכב פרוטאז לכל 1 כפול 10 ל-6 התאים.

העבירו את הצינור כדי לערבב ואז צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס ו-1,700 פעמים גרם. העבירו את הסופרנטנט המכיל את הכרומטין לצינור מיקרו-צנטריפוגה רגיל של 1.5 מיליליטר והניחו על קרח. השתמש במאגר RIPA בתוספת מעכבי פרוטאז ב-1 עד 1,000 כדי לדלל את הכרומטין כך שלכל IP יהיה נפח של 100 עד 200 מיקרוליטר. לאחר מכן הסר ציטוט שווה ערך ל-10% מאמצעי האחסון ChIP כדגימת הקלט.

הכן את הקלט על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של מאגר TE בתוספת פרוטאינאז-K ודגירה ב-55 מעלות צלזיוס למשך שעה. לאחר טיהור הקלט עם ערכת טיהור PCR, מדוד את ריכוז הקלט באמצעות ספקטרופוטומטר מיקרו נפח. רשום את התוצאות במחברת. הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזים מגנטיים חלבון שטופים A ו-G לכל IP שיבוצעו על כל דגימה ודגירה למשך שעה ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד.

הנח את הדגימה על מחזיק מגנטי ואפשר לחרוזים להיפרד. לאחר מכן העבירו את הנפח הנדרש לצינורות חדשים של 1.5 מיליליטר. הוסף את הנוגדן הרצוי לכל צינור, ולאחר מכן עטוף את המכסים בסרט פרפין מפלסטיק כדי למנוע אידוי. דגרו את הדגימות למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב כמו קודם. למחרת, סובב את הצינורות ב -2000 פעמים גרם למשך 10 שניות. לאחר מכן הוסיפו 10 מיקרוליטר חרוזים לכל IP ודגרו במשך שלוש שעות ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד.

לאחר מכן הנח את הדגימות על מעמד מגנטי ואפשר לחרוזים המגנטיים להיפרד. השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסף 150 מיקרוליטר של מאגר RIPA עם מעכבי פרוטאז לכל IP ודגר ב-4 מעלות צלזיוס ב-20 סל"ד למשך 5 דקות. לאחר תקופת הדגירה, הניחו את הדגימות על מעמד מגנטי ואפשרו לחרוזים המגנטיים להיפרד. השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסיפו 150 מיקרוליטר של מאגר ליתיום כלוריד בתוספת מעכבי פרוטאז בריכוז נמוך לכל IP ודגרו ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד למשך 5 דקות.

לאחר תקופת הדגירה, הניחו את הדגימות על מעמד מגנטי ואפשרו לחרוזים המגנטיים להיפרד. לאחר מכן השתמש בפיפטה כדי להסיר את הסופרנטנט. לאחר מכן הוסיפו לחרוזים 150 מיקרוליטר TE קר ללא מעכבי פרוטאז ודגרו ב-4 מעלות צלזיוס עם סיבוב ב-20 סל"ד למשך 5 דקות. לאחר שלב הכביסה האחרון, יש להשהות מחדש את הדגימה ב-100 מיקרוליטר של מאגר TE בתוספת הריכוז הסופי של 0.5 מיליגרם למיליליטר פרוטאינאז-K ולדגור בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך שעה.