צביעה חיסונית של נוירונים בפרוסות מוח של עכבר בעקבות הכלאה פלואורסצנטית באתרה

קח פרוסות מוח של עכבר קבועות וחדירות המכילות נוירונים, כולל נוירונים כולינרגיים המבטאים כולין אצטילטרנספראז.

הפרוסות נתונות להכלאה פלואורסצנטית באתרה כדי לזהות mRNAs מטרה הממוקמים באקסונים כולינרגיים, וכתוצאה מכך אותות מוגברים באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות, המזוהות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

הוסף תמיסת חסימה המכילה חלבונים וחומר מרווה. החלבונים מונעים קשירה לא ספציפית, וחומר המרווה מנטרל קיבוע שיורי.

דגירה עם נוגדנים ראשוניים המכוונים לכולין אצטילטרנספראז עצבי.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים ראשוניים הקשורים לכולין אצטיל-טרנספראז.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר עודפי נוגדנים, ולאחר מכן שטפו במים מזוקקים כדי להסיר שאריות חיץ.

הרכיבו את הפרוסות באמצעי הרכבה המכיל כתם גרעיני כדי לסמן את הגרעין.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, דמיין את הפרוסות כדי לדמיין את אותות ה-mRNA של המטרה והאקסונים הכולינרגיים המוכתמים בנוגדנים ספציפיים.

מכסים כל פרוסה ב-100 עד 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימה, המכילה שלושה מיליגרם למיליליטר BSA, 100 מילי-מולרי גליצין ו-0.25% טריטון X-100 ב-PBS. מכסים כל שקופית בפרפילם, ודוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, ב-100 עד 200 מיקרוליטר של נוגדן מדולל בתמיסה חוסמת לשקופיות, נעשה כאן שימוש בנוגדנים אנטי-כולין אצטיל-טרנספראז. לאחר הכיסוי, המגלשות עם פרפילם, דוגרות במשך יומיים בארבע מעלות צלזיוס. וודאו שפרוסות המוח לא יתייבשו. במידת הצורך, יש למרוח מחדש תמיסת נוגדנים נגד chAT על פרוסות מוח 24 שעות לאחר הדגירה.

לאחר שטיפת השקופיות שלוש פעמים ב-1X PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, הוסף לשקופיות 100 עד 200 מיקרוליטר של הנוגדן המשני המצומד המתאים של Alexa. מכסים בפרפילם ודוגרים במשך שעה בטמפרטורת החדר תוך הגנה מפני אור.

לאחר שחלפה השעה, שטפו את המגלשות שלוש פעמים ב-1X PBS למשך חמש דקות כל אחת כמו קודם, ולאחר מכן שטפו פעם אחת במים מזוקקים. הרכיב את השקופיות עם אמצעי הרכבה המכיל DAPI. ואז דמיינו את פרוסות המוח תחת המיקרוסקופ הקרינה.