צביעה חיסונית של נוירונים בפרוסות מוח של עכבר בעקבות הכלאה פלואורסצנטית באתרה

קח פרוסות מוח של עכבר קבועות וחדירות המכילות נוירונים, כולל נוירונים כולינרגיים המבטאים כולין אצטילטרנספראז.

הפרוסות נתונות להכלאה פלואורסצנטית באתרה כדי לזהות mRNAs מטרה הממוקמים באקסונים כולינרגיים, וכתוצאה מכך אותות מוגברים באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות, המזוהות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

הוסף תמיסת חסימה המכילה חלבונים וחומר מרווה. החלבונים מונעים קשירה לא ספציפית, וחומר המרווה מנטרל קיבוע שיורי.

דגירה עם נוגדנים ראשוניים המכוונים לכולין אצטילטרנספראז עצבי.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים ראשוניים הקשורים לכולין אצטיל-טרנספראז.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר עודפי נוגדנים, ולאחר מכן שטפו במים מזוקקים כדי להסיר שאריות חיץ.

הרכיבו את הפרוסות באמצעי הרכבה המכיל כתם גרעיני כדי לסמן את הגרעין.

באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, דמיין את הפרוסות כדי לדמיין את אותות ה-mRNA של המטרה והאקסונים הכולינרגיים המוכתמים בנוגדנים ספציפיים.

מכסים כל פרוסה ב-100 עד 200 מיקרוליטר של תמיסת חסימה, המכילה שלושה מיליגרם למיליליטר BSA, 100 מילי-מולרי גליצין ו-0.25% טריטון X-100 ב-PBS. מכסים כל שקופית בפרפילם, ודוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר הדגירה, ב-100 עד 200 מיקרוליטר של נוגדן מדולל בתמיסה חוסמת לשקופיות, נעשה כאן שימוש בנוגדנים אנטי-כולין א