תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים את היישום של Flex Station three למחקר הפרופיל הפארמקולוגי של תעלת ה-transient receptor potential או TRPA1. הדבר מבוצע תחילה על ידי הכנת תאים המבטאים תעלות TRPA1 בלוחיות מיקרוטיטר בעלות 96 בארות.

לאחר שטיפת התאים בשוטף מיקרו-פלטה, התאים נטענים בצבע פלואורסצנטי הרגיש לסידן. לאחר תקופת טעינת תאים של 4:00 AM, מתבצעים מספר שטיפות נוספות. השלב הבא של הפרוטוקול הוא הכנת פלטת התרכובות, הכוללת אגוניסט שלtrip, a one ואנטגוניסט משוער של trip, a one.

כשלב סופי, הגדרות התוכנה מוגדרות לקריאת הפלטה במערכת Flex Station three. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות קשרי תגובה למינון עבור הפעלת trip A one על ידי flu phonemic acid, ועכבה על ידי התרכובת האנטגוניסטית A. אף ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי מנגנוני הפעלת 21 על ידי מדידת זרימת סידן פנימה, ניתן ליישמה גם לחקר תפקודים של תעלות eye חדירות סידן אחרות ושל קולטנים מצומדים לחלבון G באמצעות צבעים פלואורסצנטיים רגישים לסידן או צבעים לרגישות פוטנציאל ממברנה.

היתרון המרכזי של טקטיקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימוי סידן ומיפוי ידני של פאצ'ים (patch mapping), הוא שטכניקה חסכונית זו בזמן מספקת סריקה בתושבה גבוהה (high throughput screening) עבור התפקוד והוויסות של נוסחת סידן, תעלות ברזל וקולטנים אחרים המגייסים סידן. לפני תחילת פרוטוקול זה, גדלו תאי HEC 2 93 שעברו טרנספקציה יציבה עם trip A one לצפיפות של 70 עד 90%, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל בהכנת התאים עבור בדיקת הסידן, ציפו פלטות בעלות 96 בארות על ידי העברת 50 µL של poly L ornithine לכל בארה; דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות לפחות.

לאחר הדגרה, שטפו את התאים פעם אחת עם phosphate buffered saline של KO. לאחר טיריפסין, העבירו את הכמות הרצויה של תאי HEC 2 93 למבחנה סטרילית בעלת תחתית קונית בנפח 15 מיליליטר וסובבו במערבל צנטריפוגי את הדגימה. הסירו את הנוזל העליון והשעיכו מחדש את משקע התאים שהתקבל.

בתווך גידול DMEM המועשר ב-10% סרום עוברי בקר שעבר דה-אקטיבציה תרמית, חלקו 100 µL מת сусלול התאים לכל באר בלוחית 96 הבארים. בעזרת פיפט רב-ערוצי, השאירו את הלוחית במCב למשך 30 דקות לפחות לפני העברתה למדגרת תרביות תאים לחות למשך 20 עד 44 שעות. להכנת בדיקת הסידן, הכינו תחילה את התמיסות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.

לאחר ההכנה, ערבבו 10 µL של 1 mM flu oh 4:00 AM עם 10 µL של onic. F1 27, והעבירו את כל התוכן ל-5 mL של תמיסת עיכוב (assay buffer) של flu. Oh four, המועשרת ב-0.1% bovine serum albumin.

בשלב הבא, שטפו את התאים שגודלו בלוחיות 96-בארים באמצעות HBSS בנפח של 80 µL לבאר, פעמיים, בעזרת שוטף מיקרו-לוחיות. לאחר השטיפה, הוסיפו תמיסת טעינה של Fluo-4 בנפח של 50 µL לבאר באמצעות פיפטה רב-ערוצית, והדגרימו את הלוחית בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. במהלך תקופת טעינת התאים בת שעה זו, הכינו סדרה של תמיסות אגוניסטים בריכוז פי 3, סדרה של תמיסות אנטגוניסטים בריכוז פי 3, ונפח גדול של אגוניסט בריכוז 300 µM בבופר בדיקה של Fluo-4.

העבירו 300 µL של תמיסות התרכובים המדוללות לפלטה של 96 בארות המיועדת לתרכובים. ארגנו כך שהדילול סדרתי של תרכוב מסוים והביקרות החיוביות והשליליות התואמות לו יהיו באותה עמודה של פלטת התרכובים במידת האפשר. מכיוון שתחנת ה-Flex reads קוראת עמודה אחת בכל פעם, פפטי 300 µL של תמיסת אגוניסט בריכוז 300 µM לצד כל בארה המכילה את האנטגוניסט, כשלב סופי של הכנת התאים.

שטפו את התאים הטעונים שלוש פעמים עם בופר החומצה flu oh four באמצעות שוטף המיקרופלייטים לאחר השטיפה האחרונה. השאירו 80 µL של בופר החומצה flu oh four בכל באר. כדי להתחיל את קריאת הפלטה, הפעילו את מערכת ה-Flex Station three והפעילו את תוכנת soft max Pro 5.2.

שמרו את הניסוי תחת שם קובץ חדש בשלב ההגדרה. בחרו במצב flex והזינו את הפרמטרים למדידת השפעת האגוניסט והאנטגוניסט כפי שמופיע בנוהל הכתוב. לאחר מכן, הניחו קופסת טיפים חדשה, את פלטת התרכובות ואת פלטת הקריאה במגשים המתאימים של תחנת ה-flex. שלושה.

התחילו את קריאת הפלטה על ידי לחיצה על כפתור ה-read בתוכנת ה-Soft Max Pro. מכשיר ה-Flex Station three יקרא עמודה אחת בכל פעם ויוסיף תרכובות בנקודות הזמן שהוגדרו מראש מבלי להפסיק את הקריאה. עם השלמת הריצה, ניתן לעבד את הנתונים הניסיוניים ישירות באמצעות תוכנת ה-Soft Max PRO או להעתיק ולהדביק אותם לכל תוכנת גיליון נתונים, כגון Microsoft Excel.

כדי לנתח את הנתונים, צור עקומות תגובה לריכוז עבור ה-TRPA1, אגוניסט אחד של fluphenomic acid, ועבור התרכובת המשמשת כמעכב פוטנציאלי של TRPA1, באמצעות התאמה בשיטת הריבועים הפחותים כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. TRPA1 הוא תעלת קטיונים חדירה לסידן, שהפעלתה מובילה לזרימה פנימה של סידן שניתן לזיהוי באמצעות הצבען הרגיש לסידן Fluo-4 AM. עקומות מייצגות של מהלכי הזמן של שינויי הפלואורסצנציה בתגובה לסדרה של ריכוזי fluphenomic acid או FFA מוצגות בריכוזים גבוהים יותר. FFA עורר עליות בפלואורסצנציה עם קינטיקה מהירה בהרבה מאשר בריכוזים נמוכים יותר, למרות רמות שיא דומות של פלואורסצנציה.

כדי להבחין בהבדלים אלו, נבנה קשר של תגובה לריכוז על ידי מדידת שיעורי העלייה הראשוניים של הפלואורסצנציה. עם הוספה של ריכוזים משתנים של FFA, נקבע כי הריכוז האפקטיבי החציוני (half maximal effective concentration) של FFA הוא 55.4 micromolar. מוצג גם קשר של תגובה לריכוז עבור עיכוב של תגובת סידן שגורמה על ידי FFA באמצעות תרכובת A, שהיא אנטגוניסט משוער ל-trip a one.

מינון הפחית באופן בלתי תלוי את התגובה של תאי trip A one ל-FFA עם ריכוז עיכוב חציתי מקסימלי של 4.3 micromolar. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן לחקור את הפרופילים הפרמקולוגיים של תעלות triple A one ותעלות קשורות באמצעות ה-flag station three.