Name: תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: למדו פרופיל פרמקולוגי של ערוצי TRPA1 בתאים אנושיים באמצעות FlexStation 3. שיטה זו מאפשרת סקרינג בקיבולת גבוהה לחקר מודולציה של ערוצי יונים ופיתוח תרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים בני הזוג. ג&#39;ון הנקוק, ריי גריל, אנדרו מוריס אולגה Chumakova על תמיכתם. מערכת 3 FlexStation הוא חלק מתקן הדמיה UTHSC Cytodynamic. אנו מודים גם בני הזוג. Ardem Patapoutian ומיכאל Bandell מן המחקר סקריפס מכון Genomics של מכון המחקר של נוברטיס קרן (GNF) למתן את הקו הסלולרי HEK293-hTRPA1 יציב. המחקר נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH (GM081658 כדי MXZ) וטקסס המרכז הרפואי העיכול מחלות מרכז (אל ה&quot;ה) ואת המשימה חבר / TIRR קרן (אל ה&quot;ה).

1. תא ההכנות 96-היטב צלחות עבור HEK293 תאים trasfected transiently עם TRPA1 האדם cDNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HEK293 התאים גדלים על 1-2 ימים בינונית Essential מינימלי של Dulbecco (DMEM) המכיל 4.5 מ"ג / מ"ל ​​גלוקוז (Thermo Scientific, SH3002201), בתוספת חום מומת 10% בסרום שור העובר (Invitrogen, 16000-044), 50 יחידות / ml פניצילין 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​סטרפטומיצין (Invitrogen, 15140-163). ביום transfection, את צפיפות התאים צריך להגיע 70-90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 96-Coat גם צלחות ידי pipetting 50 μl poly-L-ornithine (סיגמה P3655, 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​מים מזוקקים סטריליים) זה טוב דוגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפחות. יש לשטוף היטב כל פעם עם פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS) ללא Mg 2 + ו - Ca 2 + (Thermo Scientific, SH3002803). צלחת עשויה להשאיר את מכסה המנוע לתא תרבות למשך כמה שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גם עבור כל צלחת 96-היטב, לדלל בצינור Eppendorf 1.5-ml 0.2 מיקרוגרם cDNA של 25 μl OPTI-ממ (Invitrogen, 31985-070). בהיקף של עד פרופורציונלי לפי מספר בארות להיות transfected ידי cDNA אותו. כמו כן לדלל ב Lipofectamine נפרד 1.5-מ"ל צינור Eppendorf 0.4 μl 2000 (Invitrogen, 11668-019) ב 25 μl OPTI-ממ לכל טוב להיות transfected. סולם זה מעלה על פי המספר הכולל של הבארות להיות transfected. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקצרה המערבולת 2000 cDNA ו Lipofectamine בדילול ולתת להם לשבת בטמפרטורת החדר במשך כ - 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת נפח שווה של Lipofectamine בדילול 2000 על צינור המכיל המערבולת בדילול cDNA, ולתת התערובת בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות עד 2 שעות. במהלך הזמן הזה, להעביר את cDNA / Lipofectamine 2000 תערובת ב μl 49 / היטב צלחת פולי-L-ornithine המצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Trypsinize HEK293 תאים (שלב 1.1), לספור צפיפות התאים באמצעות hemocytometer או דלפק הרוזנת תא אוטומטי (Invitrogen, C10227), ולהעביר כמות רצויה של תאים (בדרך כלל כ ~ 125,000-150,000 תאים / טוב) ל -15 מ"ל סטרילי חרוטי התחתונה צינור צנטריפוגות. צנטריפוגה ב RPM x 1000 עבור 5 דקות. תאים Resuspend ב ~ 1,250,00-1,500,000 תאים / מ"ל ​​במדיום תרבות DMEM, בתוספת סרום חום מומת 10% שור עוברית, אך ללא אנטיביוטיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על 98 ההשעיה תא μl היטב כל המכיל את cDNA-Lipofectamine 2000 תערובת באמצעות pipetter רב או Dispenser microplate MicroFill (Bio-Tek). בואו הצלחת לשבת למכסה המנוע דקות לפחות 30 לפני הצבתו לתרבות humidified תא חממה. לדגור על 37 ° C CO, 5% 2 עבור 20-44 שעות. </li></ol> עבור HEK293 התאים ביציבות להביע TRPA1 <ol start="8" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקוב אחר שלב 1.2-96-גם צלחות מעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ועין מתנהלת בקו HEK293-hTRPA1 תא סופק בנדיבות על ידי ד"ר א Patapoutian (מכון המחקר סקריפס) ומתוחזק במדיום זהה wild-type HEK293 תאים (שלב 1.1) אך בתוספת 5 מיקרוגרם / מ"ל ​​blasticidin (Invitrogen, A1113902) ו - 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​hygromycin B (Invitrogen, 10,687,010). כאשר צפיפות התאים מגיע לכ -90%, trypsinize תאים, לספור צפיפות התאים, וכן את כמות הצנטריפוגות הרצוי של תאים ב 1000 x RPM עבור 5 דקות. תאים Resuspend בצפיפות של כ 1,000,000 תאים / מ"ל ​​במדיום תרבות זהה בתוספת דוקסיציקלין (פישר, BP26535, 0.25 מיקרוגרם / מ"ל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר על השעיית תא פולי-L-ornithine צלחות מצופה ב 100 μl / גם באמצעות pipetter רב או MicroFill (Bio-Tek). בואו הצלחת לשבת למכסה המנוע דקות לפחות 30 לפני הצבתו לתרבות humidified תא חממה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עבור 16-24 שעות. </li></ol> 2. פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שנאגרו של האנק תמיסת מלח (HBSS) משמש כפתרון תאיים. הוא מכיל (מ"מ): 137 NaCl, KCl 5.4, 0.25 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 1.3 CaCl 2, 1.0 MgSO 4, 1.0 MgCl 2, 10 גלוקוז, 10 HEPES, עם pH 7.4 המותאמת באמצעות 1N NaOH). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fluo-4 חיץ assay מכיל 2 מ"מ פרובנציד ב HBSS. הפוך את 250 המניות mM פרובנציד (Sigma, P8761) ב 0.5 N NaOH. מדולל ל HBSS ביחס של 1:125. להסתגל ל-pH 7.4 באמצעות 1 N HCl. </li></ol> 3. Cell-טעינה עם Fluo 04:00 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים 1 מ"ג Fluo, 04:00 (Invitrogen, F14202) ב DMSO 912 anhydrous μl לעשות פתרון מניות של 1 מ"מ. Fluo, 04:00 פתרון המניות יכול להיות מאוחסן ב -20 ° C למשך חודש אחד לפחות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 10 mM μl 1 Fluo-04:00 עם Pluronic 10 μl-F-127 (Invitrogen, P3000MP, 20% (w / v) פתרון DMSO) ולאחר מכן להעביר את התוכן כולו חוצץ 5 מ"ל-4 Fluo assay (שלב 2.2) בתוספת 0.1% אלבומין בסרום שור (Sigma, A9418). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים שגודלו 96-היטב צלחות (שלב 1.7 או 1.10) עם HBSS ב 80 μl / גם 2 פעמים באמצעות מכונת microplate (כגון ELx405TM מ Bio-Tek). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את Fluo-4 AM טעינה פתרון (שלב 3.2) בשעה 50 μl / גם באמצעות pipetter רב או MicroFill (Bio-Tek) ו דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו תאים 3 פעמים עם חיץ Fluo-4 assay (שלב 2.2). באמצעות מכונת microplate ELx405TM. לאחר לשטוף האחרון, להשאיר 80 ​​μl של למאגר Fluo-4 assay היטב כל אחד. </li></ol> 4. הכנת צלחת מתחם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך תקופת העמסה 1 hr התא, להכין סדרה של דילולים 3x של אגוניסטים (או היריבים) של 3x הריכוזים הסופי הרצוי למאגר Fluo-4 assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 250-300 μl של פתרונות מתחם בדילול לצלחת תרכובת 96-היטב. סדר לקבל את דילולים סדרתי של המתחם לבין שולטת חיוביות ושליליות המקביל באותה עמודה הצלחת מתחם בכל פעם זה אפשרי כי FlexStation 3 קורא טור אחד בודד בכל פעם. </li></ol> 5. פלייט קריאה FlexStation 3 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המערכת (FlexStation 3, המחשב, ואת SoftMax Pro 5.2 תוכנה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את הניסוי עם שם קובץ חדש. בשלב הגדרת, בחרו מצב FLEX והזן את הערכים הבאים: </li></ol> פרוטוקול מס '1, השפעת אגוניסט <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table1.jpg" alt="טבלה 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="טבלה 1"> פרוטוקול מס '2, אפקט נוגד <img src="/files/ftp_upload/3149/3149table2.jpg" alt="טבלה 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="טבלה 2"><ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום תיבת קצה חדש, צלחת המתחם את הצלחת לקרוא את המגשים המתאים FlexStation 3 ולחץ על "לקרוא" כפתור. FlexStation 3 יקראו עמודה אחת בכל פעם, להוסיף תרכובות בנקודות זמן מתוכנת מראש, בלי להפריע את הקריאה. זה לוקח בערך 3 דקות (5 דקות עבור פרוטוקול # 2) לסיים את הקריאה עמודה אחת והמכשיר ימשיך לקרוא את הטור הבא עם תוספות תרכובת ביצע מתוכנת על ידי המשתמש בשלב 5.2 עד שכל העמודות לקרוא. </li></ol> 6. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתוני הניסוי עשוי להיות מעובד ישירות באמצעות SoftMax Pro 5.2 תוכנה או להעתיק ולהדביק לתוך כל תוכנית של גיליון אלקטרוני, כגון Microsoft Excel. ריכוז תגובה עקומה של חומצה TRPA1 אגוניסט flufenamic (FFA) נבנה באמצעות שגרת הבאים לפחות, ריבועים הולם. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq1.jpg" alt="משוואה 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="משוואה 1"> , שבו Y הוא ציין בתגובה, Y max היא התגובה מקסימלי מנורמל, C הוא ריכוז התרופה המתאים, EC 50 הוא הריכוז הזה עורר תגובה חצי מרבית, H ו n הוא מקדם היל לעין. ריכוז עיכוב עיקול על מתחם TRPA1 המשוערת אנטגוניסט מתקבל באמצעות ריכוז קבוע של פ"א (100 מיקרומטר), בהדרגה להגדיל את הריכוז של א 'מתחם ערך 50 IC של המתחם מחושב על ידי לפחות, ריבועים הולם הבאה המשוואה. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149eq2.jpg" alt="משוואה 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="משוואה 2"> , שבו Y הוא תגובה נצפתה ו-Y מקסימום הוא מנורמל בתגובה שיא, [הנמלה] הוא מתחם המקביל ריכוז של, IC 50 הוא הריכוז אנטגוניסט שמייצר חצי מקסימלי עיכוב בתגובה-FFA עורר, ו n H הוא היל לכאורה מקדם. </li></ol> 7. נציג תוצאות: TRPA1 הוא Ca 2 +-חדיר ערוץ קטיון, הפעלת שמוביל זרם סידן כי ניתן לאתר על ידי Ca 2 + רגישים לצבוע, Fluo-4 (1-2). קו תא HEK293-hTRPA1 יציב שימש ללמוד את ריכוז בתגובה יחסים של TRPA1 אגוניסטים ואת היריבים. תאים עמוסות Fluo, 04:00, ממוקם 80 μl של למאגר assay, ולקרוא באמצעות FlexStation 3. לאחר ההקלטה פלואורסצנציה בסיסית עבור 30 שניות, 40 μl של דילול סדרתי של אגוניסט TRPA1, פ"א, כל אחד 3x הריכוז הסופי הרצוי, נוספו התאים דרך pipetter מרובת ערוצים כלולים במסגרת של מודול fluidics של FlexStation 3. השינויים הקרינה היו במעקב במשך נוסף 180 s. השינויים Fluo-4 הקרינה היחסית של כל אחד גם באו לידי ביטוי כמו ΔF = (F - F 0), שבו 0 F ו-F הם ערכי הקרינה בזמן הריבית תחילת הקריאה, בהתאמה. עקבות נציג קורסים הזמן לשינויים הקרינה בתגובה בסדרה של ריכוזים פ"א מוצגות באיור. 1. הערה עבור ארבעה ריכוזים האחרון פ"א, למרות רמות תגובה מקסימלי דומים, קינטיקה ההפעלה בבירור מהר יותר גבוה יותר מאשר בכל הריכוזים נמוכים FFA. לכן, כדי להבדיל את ההבדלים האלה, ריכוז - יחסים התגובה נבנה על ידי מדידת שיעורי הראשונית (שיפוע) של להגדיל את הקרינה על תוספת של ריכוזים שונים של פ"א (איור 2). אפקט מקסימלי halfריכוז ive (EC 50) של פ"א נקבע להיות 55.4 מיקרומטר (n = 3). כדי לבדוק את היריב המשוערת TRPA1, תרכובת, ביצענו ניסוי דומה באמצעות פרוטוקול מס '2 (שלב 2). במקרה זה, סדרה של דילולים של אנטגוניסט נוספו ב 30 שניות (40 μl של 3x ריכוזי הסופית הרצויה) ואת פ"א נוספה מאוחר יותר של 180 (60 μl של 300 מיקרומטר ריכוז סופי של 100 מיקרומטר). מתחם במינון מופחת dependently את התגובה של התאים TRPA1 פ"א עם ריכוז חצי מעכבות מקסימלי (IC 50) של 4.3 מיקרומטר (n = 3) (איור 2). <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 1"> באיור 1. הריכוז תלויי הפעלת TRPA1 האדם על ידי פ"א. עקבות הן להגדיל FFA-עוררו של הקרינה לאורך זמן (תגובות רק 60 הראשון של מוצגים בצורה טובה יותר להמחיש את קינטיקה מהירה של פ"א, עורר תגובות). לידיעתך, בריכוזים גבוהים עורר פ"א להגדיל פלואורסצנציה עם הרבה יותר מהר מאשר הקינטית בריכוזים נמוכים, למרות רמות הקרינה השיא היו דומות. <img src="/files/ftp_upload/3149/3149fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="איור 2"> איור 2 ריכוז -. קשרי בתגובה לשינוי FFA-Induced מתחם פלואורסצנציה ו-Induced עיכוב התגובה פ"א ב TRPA1 האדם לידי ביטוי ביציבות ב HEK293 תאים. Δ, ריכוז - יחסים התגובה של פ"א נקבע על ידי מדידת שיעורי הראשונית (מדרון) להגביר את הקרינה של נורמליזציה עם תוספת של ריכוזים שונים של פ"א. הו, ריכוז התגובה היחסים של עיכוב בתגובה-FFA עורר סידן על ידי אנטגוניסט TRPA1 המשוערת, תרכובת A.

<ol><li>Hu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRPA1+channels+by+fenamate+nonsteroidal+anti-inflammatory+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Activation of TRPA1 channels by fenamate nonsteroidal anti-inflammatory drugs.</a> Pflugers Arch. 459, 579-592 (2010).</li>
<li>Hu, H., Bandell, M., Petrus, M. J., Zhu, M. X., Patapoutian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc+activates+damage-sensing+TRPA1+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Zinc activates damage-sensing TRPA1 ion channels.</a> Nat Chem Biol. 5, 183-190 (2009).</li>
<li>Perney, T. M., Hirning, L. D., Leeman, S. E., Miller, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+calcium+channels+mediate+neurotransmitter+release+from+peripheral+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiple calcium channels mediate neurotransmitter release from peripheral neurons.</a> Proc Natl Acad Sci. 83, 6656-6659 (1986).</li>
<li>Mason, S. A., MacLeod, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+action+potential+duration+and+calcium+regulation+in+males+and+females%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Cardiac action potential duration and calcium regulation in males and females.</a> Biochem Biophys Res Commun. 388, 565-570 (2009).</li>
<li>Raat, N. J., Wetzels, G. E., DeMey, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-contraction+relationship+in+rat+mesenteric+arterial+smooth+muscle.+Effects+of+exogenous+and+neurogenic+noradrenaline%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Calcium-contraction relationship in rat mesenteric arterial smooth muscle. Effects of exogenous and neurogenic noradrenaline.</a> Pflugers Arch. 436, 262-269 (1998).</li>
<li>Alagarsamy, S., Johnson, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-dependent+calcium+channel+involvement+in+NMDA-induced+activation+of+NOS%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Voltage-dependent calcium channel involvement in NMDA-induced activation of NOS.</a> Neuroreport. 6, 2250-2254 (1995).</li>
<li>Su, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPM7+regulates+cell+adhesion+by+controlling+the+calcium-dependent+protease+calpain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TRPM7 regulates cell adhesion by controlling the calcium-dependent protease calpain.</a> J Biol Chem. 281, 11260-11270 (2006).</li>
<li>Dubinsky, J. M., Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+concentrations+during+%22chemical+hypoxia%22+and+excitotoxic+neuronal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium concentrations during "chemical hypoxia" and excitotoxic neuronal injury.</a> J Neurosci. 11, 2545-2551 (1991).</li>
<li>George, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+channel+activation+augments+NMDA+receptor+function+and+promotes+neurite+outgrowth+in+immature+cerebrocortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sodium channel activation augments NMDA receptor function and promotes neurite outgrowth in immature cerebrocortical neurons.</a> J Neurosci. 29, 3288-3301 (2009).</li>
<li>Price, K. L., Lummis, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FlexStation+examination+of+5-HT3+receptor+function+using+Ca2%2B+-+and+membrane+potential-sensitive+dyes%3A+advantages+and+potential+problems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">FlexStation examination of 5-HT3 receptor function using Ca2+ - and membrane potential-sensitive dyes: advantages and potential problems.</a> J Neurosci Methods. 149, 172-177 (2005).</li>
<li>Laude, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+functional+assays+of+recombinant+IP3+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Rapid functional assays of recombinant IP3 receptors.</a> Cell Calcium. 38, 45-51 (2005).</li>
<li>Marincsak, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+analgesic+drug%2C+tramadol%2C+acts+as+an+agonist+of+the+transient+receptor+potential+vanilloid-1%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">The analgesic drug, tramadol, acts as an agonist of the transient receptor potential vanilloid-1.</a> Anesth Analg. 106, 1890-1896 (2008).</li>
<li>Xie, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+high+throughput+screening+assays+against+three+subtypes+of+Ca%28v%293+T-type+channels+using+molecular+and+pharmacologic+approaches.+Assay+Drug+Dev+Technol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Validation of high throughput screening assays against three subtypes of Ca(v)3 T-type channels using molecular and pharmacologic approaches. Assay Drug Dev Technol.</a> 5, 191-203 (2007).</li>
<li>Christensen, B. N., Kochukov, M., McNearney, T. A., Taglialatela, G., Westlund, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proton-sensing+G+protein-coupled+receptor+mobilizes+calcium+in+human+synovial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Proton-sensing G protein-coupled receptor mobilizes calcium in human synovial cells.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 289, C601-C608 (2005).</li>
<li>Boulay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+expression+of+a+novel+mammalian+homolog+of+Drosophila+transient+receptor+potential+%28Trp%29+involved+in+calcium+entry+secondary+to+activation+of+receptors+coupled+by+the+Gq+class+of+G+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cloning and expression of a novel mammalian homolog of Drosophila transient receptor potential (Trp) involved in calcium entry secondary to activation of receptors coupled by the Gq class of G protein.</a> J Biol Chem. 272, 29672-29680 (1997).</li>
<li>Nanda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+screening+of+adrenergic+receptors+by+measuring+intracellular+calcium+using+the+FlexStation+scanning+fluorimeter%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Functional screening of adrenergic receptors by measuring intracellular calcium using the FlexStation scanning fluorimeter.</a> Biotechnol J. 4, 417-422 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

תאיים Ca 2 + משחק תפקידים חשובים בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים רבים, כגון שחרור הנוירוטרנסמיטר (3), פוטנציאל פעולה הלב (4), התכווצות תא שריר (5), האות תא התמרה (6-7), ואת מותם של תאים excitotoxic ( 8). מדידת תאיים Ca 2 + רמות מסייעת להבהיר שינויים פונקציונליים של Ca 2 +-חדיר ערוצי בקרום פלזמה או אברונים תאיים ואת התרומה של Ca 2 + על התהליכים לעיל (13/09). Assay יכול לשמש גם כדי לחקור את הפונקציה של ה-G-חלבון קולטנים יחד, שרבים מהם...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> FlexStation 3 </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> FLEX3 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ובכן, Pipet FlexStation טיפים </td><td> מולקולרית התקנים </td><td> 9000-0912 </td><td></td></tr><tr><td> 96-ובכן פלטות </td><td> גריינר ביו אחד </td><td> 655090 </td><td></td></tr><tr><td> 96-טוב נקה התחתונה צלחות שטוחות </td><td> שחקן המשנה </td><td> 3595 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12430-104 </td><td></td></tr><tr><td> Opti-ממ </td><td> Invitrogen </td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td> Lipofectamine 2000 </td><td> Invitrogen </td><td> 11668-019 </td><td></td></tr><tr><td> Fluo, 04:00 </td><td> Invitrogen </td><td> F14202 </td><td></td></tr><tr><td> PluronicF-127 </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> פולי-L-ornithine </td><td> סיגמא </td><td> P36551 </td><td></td></tr><tr><td> פרובנציד </td><td> סיגמא </td><td> P8761 </td><td></td></tr><tr><td> שור בסרום אלבומין </td><td> סיגמא </td><td> A9418 </td><td></td></tr></tbody></table>

תא מבוססי סידן assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות trp באמצעות ערוץ flexstation 3

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

FlexStation Devices &quot;מולקולרית 3 הוא קורא benchtop מצב מרובה microplate מסוגל מדידת הקרינה אוטומטיות רב גם הצלחות. הוא אידיאלי עבור בינוני עד תפוקה גבוהה מסכי במסגרות אקדמיות. יש לו נוזל משולב העברת מודול מצויד pipetter מרובת ערוצים והמכשיר קורא עמודה אחת בכל פעם, כדי לעקוב אחר שינויים הקרינה של מגוון רחב של ריאגנטים ניאון. לדוגמה, FlexStation 3 נעשה שימוש כדי ללמוד את הפונקציה של Ca 2 +-חדיר תעלות יונים ו-G-חלבון קולטנים מצמידים על ידי מדידת שינויים תאיים חינם Ca 2 + רמות. חלוף פוטנציאל קולטן (TRP) הערוצים הם משפחה גדולה של ערוצים קטיון nonselective כי תפקיד חשוב פונקציות פיזיולוגיים pathophysiological רבים. רוב ערוצי TRP הם סידן חדיר ולגרום זרימת סידן על ההפעלה. בסרטון הזה, אנחנו מדגימים את היישום של FlexStation 3 ללמוד את פרופיל פרמקולוגי של ערוץ TRPA1, חיישן מולקולרית עבור גירויים רעילים רבים. HEK293 תאים transiently או ביציבות מביע האדם TRPA1 ערוצים, גדל צלחות 96-היטב, עמוסים Ca 2 + רגיש צבע פלואורסצנטי, Fluo-4, בזמן אמת שינויים הקרינה בתאים אלה נמדדים לפני ובמהלך יישום אגוניסט TRPA1 באמצעות מצב FLEX של FlexStation 3. ההשפעה של אנטגוניסט TRPA1 המשוערת נבדקה גם. הנתונים מועברים ישירות מתוך התוכנה SoftMax Pro לבנות ריכוז בתגובה יחסים של TRPA1 activators ומעכבי.

וידאו זה מספק פרוטוקול מפורט לחקר פרופיל פרמקולוגי של TRPA1 ערוצי אנושי באמצעות FlexStation 3. פרוטוקול מכסה הפרטים של הכנת התאים, טוען לצבוע ותפעול של הקורא microplate, FlexStation 3.

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

ה-FlexStation 3 של Molecular Devices הוא קורא מיקרו-פלייט (microplate reader) רב-מצבי שולחני, המסוגל לבצע מדידת פלואורסצנציה אוטומטית בפלטות בעלות בארות מרובות. הוא...

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים את היישום של Flex Station three ללימוד הפרופיל הפארמקולוגי של תעלת ה-transient receptor potential או trip a one. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת תאים המבטאים תעלות trip a one בלוחות מיקרוטיטר של 96 בארות.לאחר שטיפת התאים בשוטף מיקרו-פלטות, התאים נטענים בצבע פלואורסצנטי הרגיש לסידן. לאחר תקופת טעינה של התאים ב-Flu oh 4:00 AM, מבוצעים מספר שטיפות נוספות. השלב הבא של הפרוטוקול הוא הכנת פלטת התרכובות, הכוללת אגוניסט של trip, a one ואנטגוניסט משוער של trip, a one.כשלב סופי, פרמטרי התוכנה מוגדרים לקריאת המהלוח במערכת Flex Station three. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות קשרי תגובה למנה עבור הפעלת trip A one על ידי flu phonemic acid, ועיכוב על ידי התרכובת האנטגוניסטית A. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי מנגנוני הפעלת 21 באמצעות מדידת זרימת סידן פנימה, ניתן ליישמה גם לחקר תפקודים של תעלות eye חדירות סידן אחרות ושל קולטנים המצומדים לחלבון G באמצעות צבעים פלואורסצנטיים רגישים לסידן או צבעים של פוטנציאל ממברנה.היתרון העיקרי של טקטיקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דימוי סידן ומיפוי ידני של פאץ' (patch mapping), הוא שטכניקה חוסכת זמן זו מספקת סריקה בתופעת גבוהה לתפקוד ולמודולציה של נוסחאות סידן, תעלות ברזל וקולטנים אחרים המגייסים סידן. לפני תחילת פרוטוקול זה, גדלו תאי HEC 2 93 שעברו טרנספקציה יציבה עם trip A one לצפיפות של 70% עד 90% כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל בהכנת התאים לבדיקת הסידן, ציפו פלטות של 96 בארות על ידי פיפטור של 50 µL של poly L ornithine לכל בארה; הדגירו את הפלטות בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות לפחות.לאחר הדגירה, שטפו את התאים פעם אחת עם תמיסת סליין בבפר פוספט (PBS) של KO. לאחר הטיפסין, העבירו את הכמות הרצויה של תאי HEC 2 93 למבחנה סטרילית עם תחתית קונית בנפח 15 מיליליטר וסובבו את הדגימה בצנטריפוגה. הסירו את הנוזל העליון (supernatant) ותלו את משקע התאים שנוצר.בתוך מצע גידול DMEM מועשר ב-10% serum bovine fetal שעבר אינאקטיבציה בחום, העבירו 100 µL מתלי suspension התאים לכל באער של פלטת 96 באערים. באמצעות פיפט רב-ערוצי, השאירו את הפלטה במנדף למשך 30 דקות לפחות לפני העברתה לאינקובטור לתרביות תאים עם לחות למשך 20 עד 44 שעות. להכנת בדיקת הסידן, הכינו תחילה את התמיסות כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב.לאחר ההכנה, ערבבו 10 µL של 1 mM flu oh 4:00 AM עם 10 µL של onic. F1 27, והעבירו את כל התוכן ל-5 mL של תמיסת באפר flu. Oh four assay המועשרת ב-0.1% bovine serum albumin.בשלב הבא, שטפו את התאים שגודלו בפלטות של 96 בארות באמצעות HBSS בנפח של 80 µL לבערה, פעמיים, בעזרת שוטף מיקרופלטות. לאחר השטיפה, הוסיפו תמיסת טעינה של fluo-4B בנפח של 50 µL לבערה באמצעות פיפט רב-ערוצי, והדגירו את הפלטה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת. במהלך שעת טעינת התאים, הכינו סדרה של תמיסות agonist בריכוז 3x, סדרה של תמיסות antagonist בריכוז 3x, ונפח גדול של agonist בריכוז 300 µM בבאפר של בדיקת fluo-4.העבירו 300 µL של תמיסות התרכובות המדוללות לפלטת תרכובות בעלת 96 בארות. סדרו את הדילול הסידורי של התרכובת ואת הביקורות החיוביות והשליליות המתאימות באותה עמודה של פלטת התרכובות במידת האפשר. כיוון שתחנת ה-Flex station three קוראת עמודה אחת בכל פעם, פלפטו 300 µL של תמיסת אגוניסט בריכוז 300 µM בסמוך לכל בארה המכילה את האנטגוניסט, כשלב סופי להכנת התאים.שטפו את התאים שהועמסו שלוש פעמים עם בופר חומצה flu oh four באמצעות שוטף המיקרופלטה לאחר השטיפה האחרונה. השאירו 80 µL של בופר חומצה flu oh four בכל באר. כדי להתחיל בקריאת הפלטה, הפעילו את מערכת ה-Flex Station three והפעילו את תוכנת ה-soft max Pro 5.2.שמרו את הניסוי תחת שם קובץ חדש בהגדרות. בחרו במצב flex והזינו את הפרמטרים למדידת השפעת האגוניסט והאנטגוניסט כפי שמופיע בפרוטוקול הכתוב. לאחר מכן, הניחו קופסת טיפים חדשה, את פלטת התרכובות ואת פלטת הקריאה במגשים המתאימים של תחנת ה-flex. שלושה.התחילו את קריאת הפלטה על ידי לחיצה על כפתור הקריאה (read) בתוכנת ה-Soft Max Pro. מכשיר ה-Flex Station three יקרא עמודה אחת בכל פעם ויוסיף תרכובות בנקודות הזמן שתוכננו מראש מבלי להפסיק את הקריאה. עם סיום ההרצה, ניתן לעבד את הנתונים הניסיוניים ישירות באמצעות תוכנת ה-Soft Max PRO או להעתיק ולהדביק אותם לכל תוכנת גיליון נתונים, כגון Microsoft Excel.כדי לנתח את הנתונים, צור עקומות תגובה לריכוז עבור האגוניסט flu phonemic acid ועבור התרכובת המהווה אנטגוניסט משוער, באמצעות התאמה בריבוע הפחות (least squares fitting) כפי שמתואר בנוהל הכתוב. TRPA1 הוא תעלה לקטיונים חדירה לסידן, שהפעלתה מובילה להזרמת סידן שניתן לזהות באמצעות הצבע הרגיש לסידן fluo-4 AM. עקבות מייצגים של מהלכי הזמן של שינויי הפלואורסצנציה בתגובה לסדרה של ריכוזי flu phonemic acid או FFA מוצגים בריכוזים גבוהים יותר. FFA עורר עליות בפלואורסצנציה עם קינטיקה מהירה בהרבה מאשר בריכוזים נמוכים יותר, למרות רמות שיא דומות של פלואורסצנציה.כדי להבחין בין הבדלים אלו, נבנה קשר של תגובה לריכוז על ידי מדידת קצבי העלייה הראשוניים של הפלואורסצנציה. לאחר הוספה של ריכוזים משתנים של FFA, נקבע הריכוז האפקטיבי החציוני (half maximal effective concentration) של FFA כ-55.4 micromolar. מוצג גם הקשר של תגובה לריכוז של עיכוב תגובת הסידן שגורם FFA על ידי תרכובת A, שהיא אנטגוניסט משוער ל-trip a one.מינון הפחית באופן בלתי תלוי את התגובה של תאי trip A one ל-FFA עם ריכוז עיכוב חציוני מקסימלי של 4.3 micromolar. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחקור את הפרופילים הפרמקולוגיים של triple A one ותעלות קשורות באמצעות ה-flag station three.

cell-based-calcium-assay-for-medium-to-high-throughput-screening-trp

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטות לפיתוח והאימות של assay פלואורסצנטי כמוני למדידת פעילותם של אשלגן rectifier פנימה (קיר ') ערוצים להקרנת מתחם תפוקה גבוהה מוצגות.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Assay הגיוס שתואר כאן הקרינה מבוססת סידן הוא מערכת הקרנת פרמקולוגיה ההפוכה בינוני תפוקה לזיהוי ליגנד תפקודי הפעלה (ים) של קולטני G-חלבון בשילוב יתום (GPCRs).

אפיון של רצפטורים מצמידים גרמו חלבון על ידי Assay גיוס סיד הקרינה מבוססת

כאן אנו מציגים טכניקות להדמיית אירועי Ca2+ מקומיים בתיווך IP3 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתאי יונקים שלמים הטעונים באינדיקטורים Ca2+ יחד עם אלגוריתם שהופך את הזיהוי והניתוח של אירועים אלה לאוטומטיים.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול נדון גם.

ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup&gt; 2+</sup&gt; חיישן Catcher<sup&gt; +</sup

וזמינותו הסלולר המתוארת נועד לצורך זיהוי הקולטן כימוקין CXC 4 (CXCR4)-סוכנים שמעצבת לעכב או לגרות, תחרותי או allosterically, תאיים Ca2 + שחרור שיזם CXCR4 הפעלה.

קינטי מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית Ca2 + גיוס Assay לזהות את G-חלבון בשילוב קולטן אגוניסטים היריבים, מאפננים Allosteric

טכניקות ליצירת ספרייה של פפטידים קצרים שיכולים להפעיל תאי פיסט באמצעות קולטן MRGPRX2 מתוארים. טכניקות הקשורות הן קלות, זולות, וניתן להרחיבן לקולטני תאים אחרים.

הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בקרה ותצפית כל-אופטית של פעילות תאית מופעלת בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC (iPSC-CMs) לצורך בדיקת תרופות בתפוקה גבוהה ובדיקות רעילות. מוצג כימות רב-פרמטרי של תבניות פנוטיפיות בזמן ובמרחב. ההשפעות ארוכות הטווח של סמים לאורך שעות, או מדידות עוקבות לאורך ימים, מודגמות.

בקרה אופטית בתפוקה גבוהה ורישום אות סידן בקרדיומיוציטים שמקורם ב-iPSC לבדיקת רעילות ובדיקת תרופות פנוטיפית

פרוטוקול זה מתאר שיטה לחקר חלבוני ממברנה אלקטרוגניים על ידי מדידת שינויים בפוטנציאל הממברנה. בדיקה זו מספקת פלטפורמה לקריאה פונקציונלית של תעלות יונים מרובות המבוטאות אנדוגנית בשורות תאי אפיתל.

בדיקה מבוססת פלואורסצנטיות של פוטנציאל ממברנה למחקר פונקציונלי בתפוקה גבוהה של שתי תעלות יונים אנדוגניות בשני קווי תאי אפיתל

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

המיקוד הפרמקולוגי של תעלות יונים הוא גישה מבטיחה לטיפול בגידולים מוצקים. פרוטוקולים מפורטים ניתנים לאפיון תפקוד תעלות היונים בתאים סרטניים ולהערכת ההשפעות של אפנון תעלות יונים על כדאיות הסרטן.

בדיקת תעלות יונים בתאים סרטניים

מאמר זה מציג שיטה לניטור כמותי בזמן אמת של ריכוזי יוני סידן (Ca2+) בתאים באמצעות הדמיה חד-תאית Ca2+ עם צבע Fura-2/AM. טכניקה זו מאפשרת העמסת צבע יעילה וחישוב מדויק של רמות Ca2+ באמצעות יחסי עוצמת פלואורסצנטיות, מה שהופך אותה לגישה פשוטה ומהירה ליישומי מחקר.

דימות סידן חד-תאי לחקר הפעלת תעלות יוני סידן

למדו פרופיל פרמקולוגי של ערוצי TRPA1 בתאים אנושיים באמצעות FlexStation 3. שיטה זו מאפשרת סקרינג בקיבולת גבוהה לחקר מודולציה של ערוצי יונים ופיתוח תרופות.

תא מבוססי סידן Assay עבור בינוני עד הקרנת תפוקה גבוהה של פונקציות TRP באמצעות ערוץ FlexStation 3

גלה סרטונים נוספים