הדמיה ברזולוציה גבוהה של קולטנים נוירוטרנסמיטורים בסינפסות רשתית

קח קטע רשתית של עכבר על רשת מיקרוסקופ אלקטרונים. הקטע מכיל תאי גנגליון רשתית, או RGCs, המקושרים באופן סינפטי לתאים דו-קוטביים.

תאים דו-קוטביים פרה-סינפטיים מכילים שלפוחיות נוירוטרנסמיטורים המסודרות במבנה סרט ליד הממברנה הסינפטית.

RGCs פוסט-סינפטיים מציגים קולטני נוירוטרנסמיטורים מקובצים על הממברנה שלהם. תאים אלה מסומנים בתת-יחידה B או CTB של רעלן כולרה.

יש

לשטוף עם מאגר כדי לשמור על ה-pH.

דגירה עם מאגר חוסם כדי להסוות אתרי קשירה לא ספציפיים.

דגירה עם נוגדנים ראשוניים המכוונים לקולטני המוליכים העצביים ול-CTB.

שטפו עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים לא קשורים ולשמור על ה-pH.

דגירה עם נוגדנים משניים המצומדים לננו-חלקיקי זהב בגדלים שונים, הנקשרים לנוגדנים הראשוניים, ומסמנים את מולקולות המטרה.

הסר נוגדנים לא קשורים, ולאחר מכן יבש את הדגימה באוויר.

מרחו מתכות כבדות הקושרות מקרומולקולות, והגבירו את הניגודיות.

באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים, זהה את ה-RGCs באמצעות ה-CTBs המסומנים ואתר את קולטני המוליכים העצביים המסומנים.

בשלב זה, חותכים קטעים דקים במיוחד בעובי 70 ננומטר עם אולטרה-מיקרוטום ואוספים אותם על רשתות הניקל המצופות בפחמן Formvar. שוטפים את הרשתות במים מזוקקים פעם אחת, ולאחר מכן שלוש שטיפות של TBS. לאחר מכן, דגרו את הרשתות ב-20 מיקרוליטר של 5% BSA ב-TBS למשך 30 דקות, ולאחר מכן ב-20 מיקרוליטר של תערובת המכילה אנטי-CTB עזים ונוגדנים לתת-יחידת NMDAR אחת למשך הלילה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, שטפו את הרשתות שלוש פעמים עם 20 מיקרוליטר TBS בכל פעם ב-pH 7.6. לאחר מכן, שטפו את הרשתות פעם אחת עם TBS ב-pH 8.2 למשך חמש דקות. דגרו על הרשתות במשך שעתיים עם 20 מיקרוליטר של תערובת המכילה IgG נגד ארנב חמור, יחד עם חלקיקי זהב של 10 ננומטר, ו-IgG נגד עזים של חמור יחד עם חלקיקי זהב של 18 ננומטר.

לאחר שעתיים, שטפו את הרשתות ב-20 מיקרוליטר TBS ב-pH 7.6 שלוש פעמים, ולאחר מכן שטפו במים האולטרה-טהורים. ואז לייבש את הרשתות באוויר. לאחר מכן, צבעו את הרשתות עם 5% אורניל אצטט במים מזוקקים למשך שמונה דקות, ולאחר מכן 0.3% ציטראט עופרת במים מזוקקים למשך חמש דקות בחושך.