ניטור בזמן אמת של הפעלת קולטני ריח בתאים רקומביננטיים

התחל עם צלחת מרובת בארות המכילה תאי יונקים רקומביננטיים דבקים בתמיסת גירוי בתוספת לוציפרין, מצע זוהר.

Incubate כדי לאפשר כניסת לוציפרין לתא.

תאים אלה מבטאים קולטני ריח הקשורים לממברנה יחד עם חלבוני G חוש הריח וחלבוני הובלת קולטנים.

בנוסף, התאים מבטאים חלבוני Glosensor ציטופלזמיים, חלבונים זוהרים הרגישים ל-AMP מחזורי.

הוסף תמיסת ריח הניתנת לאידוי בחלל שבין הבארות והנח את הצלחת בתוך מכשיר לומינומטר מאוזן מראש עם אותו ריח.

התחלת מדידת זוהר.

מולקולות ריח נקשרות לקולטני הריח של התאים, מפעילות את חלבון ה-G המצומד ומנתקות את תת-היחידה α של חלבון G, או Gα.

תת-היחידה Gα המנותקת נקשרת לאנזים אדנילט ציקלאז המוטבע בממברנה, ומפעילה אותו. האנזים המופעל ממיר את ה-ATPs ל-GMs מחזוריים.

AMPs מחזוריים אלה נקשרים לחלבונים גלו-חיישנים, משנים את הקונפורמציה שלהם ומאפשרים את קשירת הלוציפרין.

אינטראקציה זו מייצרת זוהר, המאשרת את הפעלת קולטני הריח.

הוסף 75 מיקרוליטר מתמיסת המגיב cAMP. הסר את תמיסת הגירוי מהבארות והוסף 25 מיקרוליטר של תמיסת ריאגנט cAMP מדוללת לכל באר. דגרו את צלחת 96 הבאר בטמפרטורת החדר בסביבה חשוכה ונטולת ריחות למשך שעתיים.

ראשית, יש לדלל את הריח אצטופנון ל-1% ב-10 מיליליטר שמן מינרלי ולכסות את הצינור. לפני תום זמן הדגירה של מגיב cAMP, הוסף 25 מיקרוליטר מתמיסת הריח לכל באר בצלחת חדשה של 96 בארות. לאחר מכן הנח את צלחת הריח הזו בתא הלומינומטר למשך חמש דקות כדי לאזן את החדר עם מולקולות ריח נדיפות. הגדר את הלומינומטר כדי להקליט את הזוהר עם אפס שניות של עיכוב במהלך 20 מחזורים של מדידת צלחת של 90 שניות, עם מרווח של 0.7 שניות בין מחזורים.

ממש לפני קריאת הצלחת, הסר את צלחת הריח מהתא. בצלחת 96 הבארות המכילה את התאים המועברים, הוסיפו 25 מיקרוליטר ריח בחלל שבין הבארות, והחזירו במהירות את הצלחת לתא. התחל את מדידת הזוהר של כל הבארות למשך 20 מחזורים תוך 30 דקות.