אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 4:15 דק׳ • April 28th, 2025
קח שקופית תא המכילה תרבית חד-שכבתית של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של מוח חולדה, או RBMECs, המחקה את שכבת תאי האנדותל של מחסום הדם-מוח.
התאים מציגים חלבוני צומת הדוקים משובשים וסיבי עקה אקטין עקב לחץ ממחסור בחמצן-גלוקוז ואחריו חמצון מחדש.
הסר את המדיום ושטוף את התאים, החל קיבוע כדי לשמר את ארכיטקטורת התא, ואז שטוף את הקיבוע העודף.
טפל בחומר ניקוי כדי לחלחל את ממברנות התאים.
דגירה עם חומר חוסם כדי להסוות אתרי כריכה לא ספציפיים.
כדי לתייג חלבוני צומת הדוק, דגרו עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים, ולאחר מכן הסירו נוגדנים לא קשורים.
דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור כדי לסמן את הנוגדנים העיקריים.
לחלופין, כדי לסמן את סיבי הלחץ, הוסף פלואידין מתויג פלואורופור.
שטפו כדי להסיר מולקולות תיוג לא קשורות.
הסר את החדר, החל מדיום הרכבה המכיל צבע קושר DNA פלואורסצנטי כדי להכתים גרעינים, ולאחר מכן אטום עם כיסוי.
באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, דמיין את חלבוני הצומת ההדוקים וסיבי הלחץ המסומנים פלואורסצנטית.
התחל בחשיפת כל באר של חד-שכבות RBMEC ל-100 עד 200 מיקרוליטר של חומרי סרום מופחתים של Opti-MEM, והמשך בדגירה שלהם למשך שעה. לאחר מכן שטפו את החלקות התא שלוש פעמים, תוך שימוש ב-100 עד 200 מיקרוליטר PBS לבאר לכל שטיפה. תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ב- PBS, ודגר את השקופיות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. ו
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים