לוקליזציה פלואורסצנטית של חלבוני צומת הדוקים וסיבי עקה בתאי אנדותל

קח שקופית תא המכילה תרבית חד-שכבתית של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים של מוח חולדה, או RBMECs, המחקה את שכבת תאי האנדותל של מחסום הדם-מוח.

התאים מציגים חלבוני צומת הדוקים משובשים וסיבי עקה אקטין עקב לחץ ממחסור בחמצן-גלוקוז ואחריו חמצון מחדש.

הסר את המדיום ושטוף את התאים, החל קיבוע כדי לשמר את ארכיטקטורת התא, ואז שטוף את הקיבוע העודף.

טפל בחומר ניקוי כדי לחלחל את ממברנות התאים.

דגירה עם חומר חוסם כדי להסוות אתרי כריכה לא ספציפיים.

כדי לתייג חלבוני צומת הדוק, דגרו עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים, ולאחר מכן הסירו נוגדנים לא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור כדי לסמן את הנוגדנים העיקריים.

לחלופין, כדי לסמן את סיבי הלחץ, הוסף פלואידין מתויג פלואורופור.

שטפו כדי להסיר מולקולות תיוג לא קשורות.

הסר את החדר, החל מדיום הרכבה המכיל צבע קושר DNA פלואורסצנטי כדי להכתים גרעינים, ולאחר מכן אטום עם כיסוי.

באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, דמיין את חלבוני הצומת ההדוקים וסיבי הלחץ המסומנים פלואורסצנטית.

התחל בחשיפת כל באר של חד-שכבות RBMEC ל-100 עד 200 מיקרוליטר של חומרי סרום מופחתים של Opti-MEM, והמשך בדגירה שלהם למשך שעה. לאחר מכן שטפו את החלקות התא שלוש פעמים, תוך שימוש ב-100 עד 200 מיקרוליטר PBS לבאר לכל שטיפה. תקן את התאים עם 4% פרפורמלדהיד ב- PBS, ודגר את השקופיות למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS כמו קודם.

כעת, חדור התאים על ידי מריחת 100 עד 200 מיקרוליטר של 0.5% טריטון X-100 ב-PBS על כל באר. ותנו לצלחת לדגור עוד 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר חדירת התאים, יש למרוח את תמיסת החסימה. ותנו לזה לפעול על התאים במשך שעה בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, בצע אימונופלואורסצנציה עבור חלבון ZO-1 או סמן F-אקטין. כדי לבצע אימונופלואורסצנציה של התאים עבור ZO-1, דגרו אותם עם הנוגדן הראשוני למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס. למחרת יש לשטוף את התאים שלוש פעמים ב- PBS, כגון בעת הסרת הקיבוע. לאחר מכן דגרו את התאים ב-100 עד 200 מיקרוליטר של נוגדן משני נגד ארנב FITC למשך שעה בטמפרטורת החדר, כדי לסמן את התאים עם רודמין פלואידין.

לאחר מריחת תמיסת החסימה למשך שעה, חשוף את התאים ל-100 עד 200 מיקרוליטר של רודמין פלואידין בדילול של 1 עד 50, עם 2% BSA PBS למשך 20 דקות. לאחר הדגירה של הנוגדן המשני או רודמין פלואידין, שטפו את התאים עם PBS שלוש פעמים שוב כמו קודם. לאחר מכן הסר את התאים על ידי קילוף האלסטי. המשך בהרכבת השקופיות, באמצעות מדיום המכיל אנטי-דהייה ו-DAPI. דמיין את התאים במיקרוסקופיה קונפוקלית במישור יחיד עם מטרה של פי 60.