ביצוע אימונוהיסטוכימיה על רקמת מוח של פרימטים שאינם אנושיים

התחילו עם קטע מוח של פרימטים לא אנושיים קבועים כימית.

הקיבוע המבוסס על אלדהיד מקשר חלבונים, שומר על מבנה הרקמה, אך משאיר כמה שאריות אלדהיד תגובתיות.

שטפו כדי להסיר את שכבת ההקפאה המקיפה את קטע הרקמה.

הוסף חומר הפחתה כדי לנטרל את קבוצות האלדהיד התגובתיות, ולייצר תוצרי לוואי של תגובה.

שטפו כדי להסיר את תוצרי הלוואי הללו וחומרים מפחיתים עודפים.

יש למרוח תמיסת חסימה כדי למנוע קשירת נוגדנים לא ספציפיים.

הוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבון המתבטא באתרים ספציפיים בקרום העצבי.

שטפו כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

הוסף נוגדנים משניים ביוטיניליים המכוונים לנוגדנים העיקריים.

שטפו כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

שכבו קומפלקסים של אבידין-ביוטין-פרוקסידאז הנקשרים לנוגדנים המשניים.

שטפו שוב כדי להסיר קומפלקסים לא קשורים.

הציגו מצע כרומוגני יחד עם מי חמצן. בנוכחות מי חמצן, האנזים פרוקסידאז מחמצן את המצע ויוצר משקעים חומים.

התחל בהעברת מקטעים בעובי 50 מיקרון של מוח פרימט מקובע של אקרולאין, המכילים את אזור העניין לצלחת בת 12 בארות המכילה PBS. שטפו את החלקים הצפים החופשיים שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן דגרו את החלקים בתמיסת נתרן בורוהידריד טרייה שהוכנה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. נדנד בעדינות ללא כיסוי.

לאחר שחלפו 30 הדקות, שאפו את הנתרן בורוהידריד והוסיפו PBS לכל באר. מניחים את הצלחת על נדנדה ומנערים במרץ במשך 10 דקות. חזור על הכביסה פעמיים נוספות, או עד שאף אחד מגז התגובה לא נשאר. חסום את החלקים על ידי דגירה בתמיסה של 2% סרום רגיל ו-0.5% ג'לטין דגים קרים, מדולל ב-PBS למשך שעה בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין.

לאחר שחלף זמן הדגירה, דגרו את החלקים ואת תמיסת הנוגדנים הראשונית עם נדנוד עדין למשך הלילה בטמפרטורת החדר. למחרת, לאחר שטיפת החלקים כמו קודם, דגרו את החלקים בתמיסת נוגדנים משנית למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר עם נדנוד עדין. לאחר שטיפת החלקים כמו קודם, דגרו באבידין ביוטין פרוקסידאז, או תמיסת ABC, למשך שעה עם נדנדה.

לאחר מכן, הכינו תמיסה טרייה של 0.05% 3,3-diaminobenzidine עם 0.005% מי חמצן מדולל ב-TBS. לאחר הכביסה, דגרו חלקים בתמיסת ה-DAB למשך שלוש עד שבע דקות עם נדנוד עדין. לאחר שהמשקעים החומים התפתחו לצבע הרצוי, עצרו את התגובה על ידי שטיפה מהירה פעמיים ב-TBS קר, ולאחר מכן באמצעות סדרה של שטיפות TBS ו-PB מתוזמנות.