צביעה אימונוהיסטוכימית של קריוסקציות רקמת קורונל של חולדות עבור מיקרוגליה ונוירונים

קח שקופית המכילה הקפאת רקמת קורונל של חולדה קבועה וחדירה.

מתאר את החלקים בעזרת עט הידרופובי כדי ליצור סביבת צביעה מבוקרת.

העבירו את החלקים לתא לחות כדי למנוע ייבוש של ריאגנטים ורקמות במהלך השלבים הבאים.

טפל בקטעים בחלבוני סרום כדי לחסום אתרי קישור לא ספציפיים.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר עודפי חלבונים בסרום.

דגירה עם נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבונים ספציפיים על מיקרוגליה ונוירונים.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור הנקשרים לנוגדנים הראשוניים.

יש לשטוף עם חוצץ כדי להסיר נוגדנים משניים לא קשורים. לאחר מכן, שטפו במים מזוקקים פעמיים.

החל מדיית הרכבה מימית כדי להגן על אות הפלורסנט, הנח כיסוי ואטום אותו.

דמיין את החלקים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לדמיין מיקרוגליה ונוירונים עם תווית חיסונית.

יבש את קצוות השקופיות, וצור גבול דוחה נוזלים סביב קצה השקף בעזרת עט פאפ, כדי להבטיח כיסוי אחיד של הנוזל ולהפחית את אפקטי הקצוות. לאחר מכן, חסום את החלקים על ידי הוספת 300 מיקרוליטר סרום ב-PBS לכל שקופית. הסרום, צריך להיות מהמין בו גדל הנוגדן המשני. במקרה זה נעשה שימוש בסרום חמורים.

ודא שתמיסת החסימה משתרעת עד קצה השקופית ומכסה לחלוטין את הרקמה כדי למנוע כתמים לא אחידים. הנח את המגלשות בתא לחות לדגירה בטמפרטורת החדר, למשך שעה. במהלך הדגירה, הכינו את הנוגדנים העיקריים. יש לדלל את הנוגדן IBA1, 1 עד 5,000 ואת הנוגדן הפאן-עצבי, 1 עד 500 לתערובת של 1% סרום חמור ב-PBS.

הסר את תמיסת החסימה, והוסף 300 מיקרוליטר מתמיסת הנוגדנים, המכילה את שני הנוגדנים המעניינים. מניחים את כל המגלשות בתא לחות, ומדגרים אותן למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס. למחרת בבוקר, שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות כל אחת.

הכן את תערובת הנוגדנים המשנית הפלואורסצנטית, על ידי דילול שניהם מ-1 עד 250, בסרום חמור של 1% ב-PBS. מוסיפים 300 מיקרוליטר מהתערובת על כל שקופית. והנח את השקופיות בתא לחות קל ומהודק למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן שטפו את השקופיות שלוש פעמים ב-PBS למשך חמש דקות כל אחת. ולבסוף, שטפו אותם במים מזוקקים כפולים. הגן על המגלשות מפני אור בזמן הכביסה ב-PBS.

הוסף כמה טיפות של מדיום הרכבה מימי, המסייע בשמירה על עוצמת אות הקרינה לכל שקופית. לאחר מכן כסו את השקף, והסירו את כל בועות האוויר שנותרו באמצעות אפליקטור עם קצה כותנה. כדי לאטום את אמצעי ההרכבה על המגלשות ולמנוע התייבשות החלקים, מצפים את הקצוות בלק. השקופיות נותרות לייבוש שטוח למשך שעה בקופסה מוגנת באור, לפני שהן מאוחסנות בכלי קל ומהודק, עטוף בנייר כסף בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.