Quantitation וניתוח של היווצרות של HO-Endonuclease מגורה טרנסלוקציות כרומוזומלית ידי Strand-סינגל חישול ב Saccharomyces cerevisiae

המטרה הכוללת של הליך זה היא לקבוע את הבקרה הגנטית של היווצרות טרנסלוקציה על ידי כריעה חד-גדילית בתאי שמרים דיפלואידים. זה מושג על ידי חיסון תרביות במושבות בודדות של גנוטיפ ספציפי וגידולן בן לילה. השלב השני של ההליך הוא לגרום להיווצרות שבירת גדיל כפול בו זמנית על ידי הו אנדונוקלאז על שני כרומוזומים על ידי הוספת גלקטוז לתרביות.

הדילול הבא של תרבויות אלה מצופה על מדיה סלקטיבית ולא סלקטיבית. השלב האחרון הוא קביעת תדירות הטרנסלוקציה על ידי ספירת מושבות הנובעות ממדיה סלקטיבית ולא סלקטיבית. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שליטה גנטית על היווצרות טרנסלוקציה על ידי גדיל בודד, כריעה באמצעות שינויים בתדירות היווצרות טרנסלוקציה מגורה בזנים של גנוטיפים שונים.

ההשלכות של טכניקה זו משתרעות על ההשלכות של חשיפה לקרינה טיפולית של חולי סרטן מכיוון ששבירה כפולה של DNA והיווצרות טרנסלוקציה הן ההשלכות העיקריות של טיפול זה. כדי להתחיל בהליך לקביעת תדירות טרנסלוקציה מגורה יש לחסן 10 עד 20 תרביות עצמאיות של מיליליטר אחד של מדיום Y שיא גליצרול לקטט עם מושבות בודדות של הגנוטיפ הרצוי, לדגור את התרביות למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס על מסובב. כאשר התרביות הגיעו לצפיפות התאים הרצויה, הוסף 20% גלקטוז לתרביות לריכוז סופי של 2%הגלקטוז יגרום לביטוי של האנדונוקלאז הו, אשר יכוון שבירות גדיל כפול באלל ההיסטורי דלתא חמש ראשוני על כרומוזום שלוש ויש לו שלושה אלל דלתא שלוש ראשוני על כרומוזום 15 מודגר למשך ארבע שעות ב-30 מעלות צלזיוס על מסובב.

השלב הבא הוא קריטי להצלחת ההליך. דילול וציפוי זהירים של התרבויות הוא הכרחי. אם היית מקבל תדרי טרנסלוקציה הניתנים לשחזור מספיק כדי לאפשר השוואות מובהקות סטטיסטית בין זנים של גנוטיפ שונה: לאחר ארבע שעות, דילול מתאים של הצלחת של התרביות למדיום חסר היסטידין וכן על YPD td כ-100 עד 200 מושבות לצלחת דגירה של צלחות ב-30 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה.

כאשר מתעוררות מושבות, ניתן לקבוע את תדירות הטרנסלוקציה. יעילות הציפוי לפני ואחרי אינדוקציה של ביטוי הו אנדונוקלאז תצביע אם נוכחותו או היעדרו של אחד מכרומוזומי הטרנסלוקציה משפיע על היכולת לשרוד את היווצרות DSB. זה מפרק עותק אחד של כרומוזום 3 וכרומוזום 15 כדי לקבוע את יעילות הציפוי לפני האינדוקציה.

ראשית, הסר כמות גדולה של תאים מכל תרבית לילה וקבע את מספר התאים על ידי ספירה עם ציטומטר המו. לאחר מכן, השתמש בדילול מתאים כדי להעלות כ-100 עד 200 תאים על דגירה של YPD למשך יומיים-שלושה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עד להיווצרות מושבות. הוסף 20% גלקטוז לתרביות הנותרות לריכוז סופי של 2% ודגירה של 30 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות כדי לקבוע את יעילות הציפוי לאחר האינדוקציה.

הסר כמות תאים מכל תרבית לאחר ארבע שעות של אינדוקציה וקבע את מספר התאים על ידי ציטומטר המו ספירת צלחת כ-100 עד 200 תאים באמצעות דילול מתאים על דגירה של YPD למשך יומיים-שלושה ב-30 מעלות צלזיוס עד להיווצרות מושבות. ברגע שנוצרות מושבות על הצלחות ניתן לקבוע את יעילות הציפוי. ניתן לבחון שיבוטים הנושאים טרנסלוקציה משוערים על ידי כתם דרומי.

הליך זה משתמש ב-DNA גנומי שהוכן משריקה בודדת בתוספת מושבה רקומביננטית מכל ניסוי עצמאי, לעכל כארבעה מיקרוגרם מכל דגימת DNA עם BAM H, אנדונוקלאז הגבלה אחת, BAM H אחד, שברים מעוכלים על 0.7%aros she ולאחר מכן מועבר לקרום ניילון טעון חיובי הכלאה עם בדיקה מסומנת P 32 המתקבלת על ידי תחול אקראי עם שיבוט גנומי אחד של 1.8 קילו-בסיס, BMH אחד, שיבוט גנומי אחד המכיל את ה-HIS שלושה גן. דמיין שברי DNA על ידי רדיוגרפיה אוטומטית או הדמיית פוספו. דרך נוספת לבחון שיבוטים נושאי טרנסלוקציה משוערים היא על ידי ניתוח עלילת כרומוזומים.

כרומוזומים מוכנים תחילה משריקות נבחרות בתוספת רקומביננטים בתקעי ארוס כרומוזומים נפרדים על ג'ל 1% ארוס בשדה חשמלי הומוגני מהודק קווי מתאר או שף ב-14 מעלות צלזיוס. הפרמטרים הבאים משמשים בלוק ראשון 14 מעלות צלזיוס, זמן מיתוג 72 ו-15 שעות בשישה וולט סנטימטר, בלוק שני, 14 מעלות צלזיוס, זמן מיתוג 122 ו-11 שעות בשישה וולט לסנטימטר. בסיום האלקטרופורזה, דמיין כרומוזומים על ידי צביעת הג'ל בברומיד AUM למשך 30 דקות, ולאחר מכן הקרנה ב-UV וכרומוזומי עיכוב והעברת מים מזוקקים לקרום טעון חיובי על ידי פעולה נימית.

תנאי דנטורציה מתכלאים עם בדיקה מסומנת P 32 המתקבלת על ידי תחול אקראי עם 1.8 קילו-בסיס, bam H, שיבוט גנומי אחד המכיל את השריקה. שלושה גנים מדמים כרומוזומים על ידי רדיוגרפיה אוטומטית או הדמיית פוספו. ניתן לחשב את תדירות הטרנסלוקציות הכרומוזומליות על ידי חלוקת מספר המושבות הפוטוטרופיות של היסטמין במספר הכולל של תאים ברי קיימא שנקבע על ידי ציפוי על YPD.

בדוגמה זו, תדירות הרקומבינציה המחושבת היא כ-3%ניתן לבצע את הבדיקה עבור תדרי טרנסלוקציה מגורה באמצעות זנים של גנוטיפים שונים כדי להשוות הבדלים ביכולת לתקן שברים של גדיל כפול על ידי גדיל בודד. כריעה כפי שמוצג בגרף מייצג זה. תדרי הטרנסלוקציה שהושגו הן באופן סלקטיבי והן באופן סלקטיבי עם ההומוזיגוט RAD 51 דלתא אפס היו שונים סטטיסטית מאלה שהתקבלו באמצעות התנאים המקבילים עם הזן מסוג הבר הן לפני ואחרי ציפוי האינדוקציה.

היעילות נקבעת על ידי חלוקת המספר הכולל של תאים יוצרי מושבה בת קיימא במספר הכולל של גופי התאים בתרבית שנקבע על ידי ספירת ציטומטר המו כפי שמוצג בטבלה זו לפני ואחרי ציפוי אינדוקציה. היעילות לא הייתה שונה באופן משמעותי עבור תאים מסוג בר, מה שמצביע על כך שנוכחותו או היעדרו של אחד מכרומוזומי הטרנסלוקציה אינו משפיע על היכולת לשרוד. היווצרות DSB.

ניתן לבחון שיבוטים נושאי טרנסלוקציה משוערים על ידי ניתוח כתמים דרומיים גנומיים. ייצוג גרפי של כרומוזומים רלוונטיים לפני ואחרי היווצרות טרנסלוקציה מוצג כאן. גדלים של שברי הגבלה המכילים רצפים רלוונטיים שנוצרו על ידי BAM H עיכול אחד של DNA גנומי מזני אב ורקומביננטיים ונחשפו על כתמים על ידי הכלאה עם BAM H 1.8 קילו-בסיס.

שלושת השיבוטים הגנומיים שלו רשומים בזוגות קילו-בסיסים לניתוח כתמים דרומיים. DNA גנומי מתעכל עם BMH אנדונוקלאז אחד ועובר הכלאה ל-P 32 המסומן 1.8 קילו-בסיס. שלושת הגשושיות שלו כדי להמחיש את שברי האבחון הללו.

0.8 קילובסיס HIS שלוש דלתא 201.7 קילו-בסיס היס שלוש דלתא שלוש פריים ארבעה קילו-בסיס T 3 15 5 קילו-בסיס T 15 שלושה ושמונה קילו-בסיס היס שלושה דלתא חמישה שברים ראשוניים. נתיב A הוא דיפלואיד האב. נתיב B הוא רקומביננט של טרנסלוקציה לא הדדית ונתיב C הוא טרנסלוקציה הדדית פלוס שלו.

ניתן להשתמש בניתוח BLO כרומוזומלי רקומביננטי גם כדי לבחון שיבוטים נושאי טרנסלוקציה. כרומוזומים שלמים המוכנים בפקקי ארוס מופרדים על ידי אלקטרופורזה של השף והג'ל מוכתם באירידיום ברומיד ומומחש באור UV. לאחר מכן הכרומוזומים המופרדים נמחקים לניילון ועוברים הכלאה עם P 32 המסומן 1.8 קילו-בסיס.

שלושת הבדיקה שלו כדי לדמיין את כרומוזום 1.1 מגה-בסיס שלם, 15.8 מגה-בסיס T 15, שלושה כרומוזום טרנסלוקציה, 0.6 מגה-בסיס T, שלושה, כרומוזום טרנסלוקציה 15 ו-0.3 מגה-בסיס כרומוזום שלם שלוש. נתיב A הוא האב שנפרס. נתיב B הוא A שלו פלוס טרנסלוקציה לא הדדית רקומביננטית, ונתיב C הוא רקומביננט טרנסלוקציה הדדית פלוס שלו.

לאחר צפייה בסרטון זה, אתה אמור להבין היטב כיצד לקבוע את תדירות היווצרות הטרנסלוקציה לאחר הפסקות מרובות של גדיל כפול