Name: ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-08-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 45 s
Description: למדו שיטה לבידוד DNA ויראלי בטוהר גבוה מנוקלאוקפסידים של הרפס וירוס בתאים נגועים. הפרוטוקול כולל אולטרה-סנטריפוגציה וחילוץ פנול-כלורופורם ליישומים מולקולריים מתקדמים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

החוקרים להעריך את תרומתם של גרג סמית&#39;, ליסה פומרנץ, מאט ליימן, Marlies אלדריג&#39;, הלינה Staniszewska Goraczniak ואנשי המעבדה Enquist בפרוטוקול זה כיוון עדין.

1. יום ראשון: זיהום ויראלי והכנת Buffers <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו מאכלים 50-10 (בקוטר 15 ס"מ) של התרבות תאים ורקמות של זיהום, למשל PK-15 תאים וירוס pseudorabies (PRV) או תאים Vero עבור נגיף הרפס סימפלקס (HSV). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התאים 95 - ומחוברות 100%, להדביק אותם (משרד הפנים) של 5-10. כדי לעשות זאת, לחסן כל צלחת באמצעות מניות וירוס בהיקף כולל של 4 מ"ל לכל צלחת, ואז דגירה הצלחות במשך שעה 1 ב 37 ° C. צלחות רוק בעדינות כל 15 דקות על מנת להבטיח כי monolayer תא נשארת מצופה באופן מלא על ידי inoculum את הנגיף. בינתיים, לחמם את המדיום לשלב הבא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שעה של זיהום, לשאוב inoculum ויראלי מן הלוחות, מוסיפים 15 מ"ל של מדיום חם, דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 12-20 שעות חממה humidified. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מאגרים LCM (ראה לוח 1) ו רוק לילה ב 4 ° C עבור ערבוב יסודי. הכן TNE עבור resuspension של ה-DNA הנגיפי (ראה טבלה 2). </li></ol> 2. היום השני, שלב 1: תמוגה תא ultracentrifugation <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראייה מאשרים כי זיהום של תאים גרמה השפעה cytopathic אחיד (CPE). אפשר זיהום להתקדם עד התאים כולם אספו, אבל לא הרים את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גרדו את התאים הנגועים לתוך המדיום, ולשלב תאים בינוניים לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל. מספר צינורות חרוטי הדרושים צעד זה יהיה תלוי במספר כלים המשמשים זיהום שלב 1.2 לעיל, כגון: one 50 מ"ל צינור חרוטי ניתן להשתמש גלולה מקסימלית של 3 מנות של 15 מ"ל כל אחד בינוני אופציונלי:. שטפו את צלחות עם 10 מ"ל PBS ולשלב עם התאים ובינוניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים צנטריפוגה בינוני למשך 10 דקות לעבר כוח 2000 centifugal יחסית (RCF) בטמפרטורת החדר, ואז לשאוב supernatant ו resuspend כל גלולה ב 10 מ"ל של PBS. אם גלולה מדלקת נגיפית התפשט לתוך צינורות חרוטי מרובים שלב 2.2, אלה יכולים להיות recombined לתוך הגליל האחד חרוט על שלב זה. חזור צנטריפוגה והשאיפה אופציונלי:. גלולה זה עשוי להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס פרוטוקול המשיכה במועד מאוחר יותר. </li></ol> 3. יום שני, שלב 2: ultracentrifugation שמרו על תא גלולה ואת מאגרים LCM על הקרח ככל האפשר במהלך השלבים הבאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף β-mercaptoethanol כדי גליצרול 0% - חיץ LCM. בגין קירור ultracentrifuge (לצעד 3.9 להלן) על ידי הגדרת אותו 4 ° C ו הפעלת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 5 מ"ל של גליצרול 0% - חיץ LCM עד שהוא כבר לא גבשושית. אם יש צורך, מערבולת הצינור כדי לשבור את כל תא שלא נמס גלולה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלץ על ידי הוספת 1.5 מ"ל פריאון (1,1,2-trichloro-1-,2,2 trifluoroethane) ו vortexing במרץ. מיד צנטריפוגות במשך 10 דקות ב 2000 RCF בטמפרטורה של 4 ° C. אסוף את השכבה העליונה עם קצה פיפטה רחב נשא (הימנעות ממשק) ומעבירים צינור חדש אופציונלי:. גלולה אם הוא מוצק דביקות, אתה יכול במהירות לשפוך את השכבה העליונה לתוך צינור חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מיצוי פריאון ו צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את השכבה העליונה (~ 5 מ"ל) ולהעביר צינור polyallomer חדש ultracentrifuge. הוסף β-mercaptoethanol כדי גליצרול השניים הנותרים - מאגרים LCM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שיפוע בצינור צנטריפוגות polyallomer ידי underlaying תמצית פריאון (השכבה העליונה) עם 3 מ"ל של גליצרול 5% - LCM (השכבה האמצעית), ולאחר מכן underlaying שוב עם 2.5 מ"ל של גליצרול 45% - LCM (השכבה התחתונה). השתמש פיפטה דקה כדי למנוע גלישה של תוכן הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת הצורך, להכין צינור איזון המקבילה באמצעות אותן הפרופורציות של מאגרים LCM. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת צינורות לסלים ultracentrifuge. מאזן סלים אל תוך 0.1 גרם אחד של השני, על ידי הוספת בעדינות גליצרול 0% תוספת - חיץ LCM אל השכבה העליונה (~ 50-100 μl בכל פעם). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש ultracentrifuge קר עם דלי הרוטור אופקי או נדנוד, לסובב את דגימות מאוזנת במשך שעה 1 ב 77,000 RCF (למשל 25,000 סל"ד עבור רוטור SW41Ti) בטמפרטורה של 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ultracentrifugation, להפוך וו זכוכית ללכוד DNA צף בשלב אתנול משקעים (4.6 להלן). החזק את שני הקצוות של pipet כוס פסטר להשעות את החלק האמצעי מעל להבה. כאשר קטע של זכוכית מותכת כמעט, למשוך בעדינות למתוח את הכוס, לכופף אותו בעדינות כדי ליצור וו זווית בחוזקה (&lt;90 מעלות), ולמשוך בחדות לאטום את הסוף. אם קצה הקרס זכוכית פתוח, להחזיק את קצה מעל להבה, כך זכוכית נמס מספיק כדי לסגור אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ultracentrifugation, אתה צריך לראות דק אטום גלולה עם נקודה כהה באמצע. בזהירות לשאוב את הנוזל מתוך הצינור, כולל טפטופים לאורך הצדדים, אך הימנעות גלולה בחלק התחתון של הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 0.5 מ"ל TNE בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו גלולה לשבת לפחות 10 דקות כדי לאפשר הידרציה של גלולה. Optional: גלולה עשוי גם resuspend ב TNE לילה, אם שמרו על 4 ° C. </li></ol> 4. יום שלישי: "Ghost" DNA רטיבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את גלולה ידי pipetting עם קצה פיפטה בקוטר קטן (למשל טיפ פיפטה p200). אל תדאג הגז בשלב זה, כי ה-DNA הנגיפי נכלל עדיין capsids בשלב זה. מוסיפים את ריאגנטים הבא שפופרת המכילה את גלולה ויראלי, בטמפרטורת החדר, כדי להרוס capsids: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4.25 מ"ל TNE </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.25 מ"ל 10% SDS </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 מ"ג proteinase K </li></ul> לערבב בעדינות רוק ריאגנטים אלה. לא צריך להיות עלייה קלה צמיגות. </li></ol> היזהרו הגז מכאן ואילך, כמו למשל להשתמש בקוטר גדול pipettes ואינם המערבולת חומר ויראלי <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמצית חלבונים נגיפיים על ידי הוספת 5 מ"ל של פנול, כלורופורם ומיד מתחילים היפוך או vortexing לשמור על אמולסיה. מערבבים במשך 10 שניות, ואז בצנטריפוגה אמולסיה במשך 5 דקות ב RCF 2000 בטמפרטורת החדר. אסוף את השכבה העליונה עם קצה פיפטה רחב לשעמם, הימנעות ממשק, ולהעביר צינור חדש אופציונלי:. השתמש נעילת שלב ג'ל (PLG) הצינורות בשלב זה, כדי למנוע זיהום מממשק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על מיצוי פנול, כלורופורם צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר החילוץ פנול, כלורופורם השני, לאסוף את השכבה העליונה לתוך שפופרת 30 מ"ל קורקס זכוכית ומקררים את הצינור ב -20 מעלות במשך 10-15 דקות, לדאוג שזה לא להקפיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ"ל של אתנול קרים כקרח, לכסות את הצינור (למשל על ידי מתיחת חתיכת Parafilm M מעל), וכן להפוך לערבב מיד. Watch עבור ה-DNA של "רוח רפאים" להופיע, אשר מורכב לזרז חבלי דק. הפוך את הצינור בעדינות לתערובת נוספת לגרום DNA דביק משקעים לאשכול יחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש וו זכוכית כדי ללכוד את רוח ה-DNA (S). בזהירות למחוק את ה-DNA כדי להסיר את נוזל עודף, ואז למקם את הקרס (טיפ למטה) לתוך צינור 1.5 מ"ל ולאפשר לו להתייבש. הוסף 0.25-0.5 מ"ל של TE לפזר את רוח ה-DNA. אפשר resuspension של ה-DNA כדי להמשיך לפחות שעה אחת. חנות ה-DNA ב 4 ° C. אופציונלי: כדי למקסם את התשואה ה-DNA, לנתק את הקרס זכוכית לתוך צינור 1.5 מ"ל, כך resuspension את שברי זכוכית יכול להמשיך לאורך זמן. </li></ol> 5. נציג תוצאות עם גבוה מספיק משרד הפנים, התאים צריכים להשיג CPE מלא בתוך זיהום ~ 18 שעות שלאחר (HPI) עבור wild-type זנים PRV, ו ~ 24 HPI עבור wild-type HSV-1 זנים (איור 1). לאחר התא הנגוע גלולה שנקטפו, השלבים פרוטוקול הנותרים ניתן להשלים ביום אחד ארוך או ביצעו במשך יומיים (איור 2). כאשר מכינים קרסים זכוכית כדי ללכוד את רוח ה-DNA, חשוב להפוך את זווית וו להיות פחות מ 90 מעלות, כדי שאחר כך הוא יכול להשתלב בבסיס צינור 1.5 מ"ל (איור 3). איטום קצה הקרס הזה מונע אובדן DNA בתוך pipet. רוחות DNA טופס במהלך השלב המשקעים יופיע, חוטים לבנים חבלי (איור 4). אלה המצרפי להיצמד זו לזו ו / או את הקרס זכוכית להשתמש כדי ללכוד את הדנ"א. לפיכך הקרס זכוכית אותו ניתן לאסוף את הנושאים מרובות דנ"א מתוך הפתרון משקעים. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> בחר בעמודה בהתבסס על נפח הרצויה: </td><td> 10 מ"ל </td><td> 15 מ"ל </td><td> 20 מ"ל </td><td> 40 מ"ל </td></tr><tr><td> KCl 1M </td><td> 1.3 מ"ל </td><td> 1.9 מ"ל </td><td> 2.5 מ"ל </td><td> 5 מ"ל </td></tr><tr><td> 1M טריס (pH 7.4) </td><td> 300 μl </td><td> 450 μl </td><td> 600 μl </td><td> 1.2 מ"ל </td></tr><tr><td> 1M MgCl 2 </td><td> 50 μl </td><td> 75 μl </td><td> 100 μl </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> 0.5 EDTA </td><td> 10 μl </td><td> 15 μl </td><td> 20 μl </td><td> 40 μl </td></tr><tr><td> NP40/IGEPAL </td><td> 50 μl </td><td> 75 μl </td><td> 100 μl </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> β-mercaptoethanol (להוסיף מיד לפני השימוש) </td><td> 4.3 μl </td><td> 6.5 μl </td><td> 8.6 μl </td><td> 17.2 μl </td></tr><tr><td colspan="5"></td></tr><tr><td colspan="5"> השתמש הפרופורציות של גליצרול אחוז הרצוי (0, 5 או 45%) </td></tr><tr><td> 0% גליצרול </td><td> אף אחד </td><td> אף אחד </td><td> אף אחד </td><td> אף אחד </td></tr><tr><td> מים </td><td> 8.3 מ"ל </td><td> 12.5 מ"ל </td><td> 16.7 מ"ל </td><td> 33.4 מ"ל </td></tr><tr><td> 5% גליצרול </td><td> 0.5 מ"ל </td><td> 0.8 מ"ל </td><td> 1.0 מ"ל </td><td> 2.0 מ"ל </td></tr><tr><td> מים </td><td> 7.8 מ"ל </td><td> 11.7 מ"ל </td><td> 15.7 מ"ל </td><td> 31.4 מ"ל </td></tr><tr><td> 45% glycerol </td><td> 4.5 מ"ל </td><td> 6.8 מ"ל </td><td> 9.0 מ"ל </td><td> 18.0 מ"ל </td></tr><tr><td> מים </td><td> 3.8 מ"ל </td><td> 5.7 מ"ל </td><td> 7.7 מ"ל </td><td> 15.4 מ"ל </td></tr></tbody></table> טבלה 1. מתכונים להכנת מאגרים LCM <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לקבלת נפח 50 מ"ל </td></tr><tr><td> 5 מ"ל NaCl 1M </td></tr><tr><td> 2.5 מ"ל 1M טריס, pH 7.5 </td></tr><tr><td> 1 מ"ל EDTA 0.5 </td></tr><tr><td> 41.5 מ"ל H 2 O </td></tr></tbody></table> טבלה 2. הכנת TNE (0.1 M NaCl, 50 מ"מ טריס, pH 7.5, 10 mM EDTA) <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לקבלת נפח 1 ליטר </td></tr><tr><td> 0.2 גרם KCl </td></tr><tr><td> 0.2 גרם KH 2 PO 4 </td></tr><tr><td> 8 גרם NaCl </td></tr><tr><td> 1.15g Na 2 HPO 4 </td></tr><tr><td> H 2 O עד 1 ליטר </td></tr></tbody></table> לוח 3. הכנה של PBS (2.7 mM KCl; 1.5 מ"מ KH 2 PO 4; 137 mM NaCl, 8.1 mM Na 2 HPO 4; pH 7.0) <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig1.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. PK15 תאים (א) לפני ההדבקה, (ב) באמצע דרך זיהומים, (ג) את ההשפעה cytopathic (CPE), לאחר ריבוי גבוה של זיהום. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig2.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. סקירה כללית של פרוטוקול. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig3.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. שלוש דוגמאות מייצגות של זכוכית ווים לאיסוף רוחות ה-DNA הנגיפי. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3151/3151fig4.jpg" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. למשל נציג של "רוח רפאים" בנוי היטב ורב DNA.

<ol><li>Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+variability+in+clinical+and+laboratory+isolates+of+herpes+simplex+virus+1+reveals+new+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations.</a> J Virol. 84, 5303-5313 (2010).</li>
<li>Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+pseudorabies+virus+strains+expressing+red+fluorescent+proteins%3A+new+tools+for+multisynaptic+labeling+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications.</a> J Virol. 77, 10106-10112 (2003).</li>
<li>Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpesviruses+carrying+a+Brainbow+cassette+reveal+replication+and+expression+of+limited+numbers+of+incoming+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes.</a> Nat Commun. 1, 146-146 (2010).</li>
<li>Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+of+herpes+simplex+type+1+DNA+fragments+in+a+bacteriophage+lambda+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector.</a> Science. 203, 541-544 (1979).</li>
<li>Smith, G. A., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+transposon+mutagenesis+in+Escherichia+coli+of+a+full-length+infectious+clone+of+pseudorabies+virus%2C+an+alphaherpesvirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus.</a> J Virol. 73, 6405-6414 (1999).</li>
<li>Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFlint%2C+SJ+%22Principles+of+virology%22">Principles of virology</a>. , 3rd edn, ASM Press. (2008).</li>
<li>Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pseudorabies+virus%3A+impact+on+neurovirology+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).</li>
<li>Roizman, B., Pellett, P. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoizman%2C+B+%22Fields+Virology%22">Fields Virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , 2 ed, Lippincott Williams & Wilkins. 2381-2397 (2001).</li>
<li>Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+analysis+of+freon+substitutes+in+the+purification+of+reovirus+and+calicivirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus.</a> J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).</li>
<li>Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+simplified+micromethod+for+subtyping+varicella-zoster+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Virol%22%5BJournal%5D)">A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus.</a> J Med Virol. 31, 129-134 (1990).</li>
<li>Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence-based+monitoring+of+in+vivo+neural+activity+using+a+circuit-tracing+pseudorabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus.</a> PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

חלקים של פרוטוקול זה פותחו במקור עבור בידוד הדנ&quot;א הוויראלי BSL4 התנאים, אבל זה מתאים באותה מידה שאינם BSL תנאים. 4 אנו בדרך כלל להשתמש בפרוטוקול זה על מנת לבודד דנ&quot;א של אלפא herpesviruses PRV ו HSV-1, אשר יש הגנום דנ&quot;א מוקף proteinaceous capsid ומוקף במעטפה השומנים. 7,8 אולם סביר להתאמה ישירות אחרות נגיפי DNA גדולות, כולל בטא ו גמא ו herpesviruses adenoviruses. עקירות דומות משמשות לאיתור וירוסים RNA, כמו גם 9. <p class="jove_cont...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם מגיב </td><td> חברה </td><td> מספר קטלוגי </td><td> תגובות </td></tr><tr><td> פריאון (1,1,2-trichloro-1-,2,2 trifluoroethane) </td><td> דיג </td><td> T178-4 </td><td> בדוק עם המוסד שלך לקבלת הנחיות לסילוק המתאים פריאון המכילים פסולת, או לראות מנדז et al. חלופות פריאון פוטנציאליים. 9 </td></tr><tr><td> ג&#39;ל שלב הנעילה צינורות, קיבולת 15 מ&quot;ל כבד </td><td> 5 PRIME </td><td> 2302850 </td><td> אופציונלי </td></tr><tr><td> Polyallomer צינורות ultracentrifuge </td><td> Beckman * </td><td> 331372 * </td><td> * צינורות בחר מתאים ultracentrifuge שלך, אלה כלולים כדוגמה בלבד </td></tr><tr><td> NP-40 / IGEPAL </td><td> סיגמא </td><td> I-3021 </td><td></td></tr><tr><td> PK-15 תאים </td><td> ATCC </td><td> CCL-33 </td><td></td></tr><tr><td> Vero תאים </td><td> ATCC </td><td> CCL-81 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> HyClone </td><td> SH30028.03 </td><td></td></tr></tbody></table>

ההכנה של ה-dna ויראלי של nucleocapsids

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

וירוסים הם טפילים הסלולר מחייבות, ולכן המחקר של ה-DNA שלהם מחייב לבודד חומר ויראלי מן התא המארח מזהמים ו-DNA. יישומים במורד כמה דורשים כמויות גדולות של DNA ויראלי טהור, הניתן על ידי פרוטוקול זה. יישומים אלה כוללים רצף הגנום הויראלי, שם את הסרת DNA המארח הוא חיוני כדי לייעל את התפוקה נתונים עבור רצפים ויראלי, ואת הייצור של זנים חדשים רקומביננטי ויראלי, שבה שותף transfection מטוהרים של ה-DNA הנגיפי פלסמיד ו ליניארי מאפשר רקומבינציה. 1,2, 3 תהליך זה מנצל שילוב של עקירות וצפיפות מבוססי צנטריפוגה כדי לבודד מטוהרים DNA ההרפס ליניארי nucleocapsid מן התאים הנגועים. 4,5 השלבים טיהור ראשוני במטרה לבודד capsids ויראלי מטוהרים, המכילים ולהגן על ה-DNA הנגיפי במהלך עקירות צעדים צנטריפוגה כי להסיר חלבונים ו-DNA התאי. תמוגה של nucleocapsids אז משחרר ה-DNA הנגיפי, ושני האחרונים פנול, כלורופורם צעדים להסיר החלבונים הנותרים. ה-DNA הסופי שנתפסו מפתרון מרוכז מאוד טהור, עם OD 260/280 ממוצע של 1.90. בהתאם לכמות של תאים נגועים בשימוש, טווח התשואות של ה-DNA הנגיפי של 150-800 מיקרוגרם או יותר. טוהר DNA זה עושה את זה יציב במהלך האחסון לטווח ארוך ב 4C. זהו ה-DNA ובכך אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections. לפני תחילת הפרוטוקול, חשוב לדעת את המספר הממוצע של התאים לכל תבשיל (למשל ממוצע של 8 x 10 6 PK-15 תאים בצלחת ומחוברות 15 ס&quot;מ), ואת titer של המניה ויראלי לשמש ( למשל, 1 x 10 8 פלאק יוצרי יחידות מ&quot;ל). אלה נחוצים כדי לחשב את הריבוי המתאים של זיהום (משרד הפנים) עבור הפרוטוקול. 6 למשל, להדביק one 15 ס&quot;מ צלחת של PK-15 תאים עם המניה ויראלי לעיל, משרד הפנים של 5, תשתמש 400 μl של מניות ויראלי לדלל את זה עם 3.6 מ&quot;ל של מדיום (נפח חיסון הכולל של 4 מ&quot;ל עבור one צלחת 15 ס&quot;מ). הכנות מרובות דנ&quot;א ויראלי ניתן להכין בו זמנית. מספר הכנות סימולטני מוגבל רק על ידי מספר צינורות בידי הרוטור ultracentrifuge (אחד לכל וירוס, ראה שלב 3.9 להלן). כאן אנו מתארים את התהליך כאילו נעשה על וירוס אחד.

אנו מתארים את תהליך של בידוד הטוהר גבוהה ההרפס DNA nucleocapsid מן התאים הנגועים. ה-DNA הסופי שנתפסו מן הפתרון של ריכוז הטוהר גבוהה, מה שהופך אותו אידיאלי עבור סידור תפוקה גבוהה, איכות גבוהה התגובות PCR, ו transfections לייצר recombinants ויראלי חדש.

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

וירוסים הם טפילים תאיים אובליגטוריים, ולכן חקר ה-DNA שלהם מחייב בידוד של החומר הווירוסלי מזיהומים ומ-DNA של תאי המארח. ...

סרטון זה מדגים הליך לבידוד DNA של קפס uncoated-נוקלאי וירוסלי בטוהר גבוה מתאים תאים נגועים. ראשית, ממברנות ליפידיות עוברות דנטורציה באמצעות מיצוי חופשי כפול. לאחר מכן, הדגימה עוברת אולטרה-צנטריפוגה כדי לשקע את הקפסונות-הנוקלאיות של הווירוס ולהפריד אותן מרכיבים תאיים ווירוסליים קלים יותר.מוסיפים דטרגנטים ו-proteinase K כדי לשחרר את ה-DNA הנגיפי מהנוקלאוקפסידים שהשקיעו. לאחר מכן, מבצעים שתי סבבים של מיצוי בפניל כלורופורם כדי להסיר את כל החלבונים שנותרו. לבסוף, ה-DNA הנגיפי משוקק בתמיסה.בסופו של דבר, התוצאות מראות כי DNA ויראלי רב-ריכוז וטהור בודד מהתאים המודבקים הללו. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות שאינן כוללות מיצויים חופשיים או אולטרסנטריפוגציה, הוא של-DNA הויראלי המופק כאן יש רמות נמוכות מאוד של זיהום ב-DNA של המארח, מה שהופך אותו לאידיאלי להליכים המשכיים כגון PCR וריצוף עמוק של גנומים ויראליים. השתמשנו בשיטה זו לראשונה בימיה הראשונים של עבודת ה-DNA רקומביננטי, כאשר אמצעי זהירות נוספים היו בעלי חשיבות גבוהה.פיתחנו את הפרוצדורה הזו כדי לבודד DNA ויראלי בזמן עבודה בתוך כפפה (glove box) תחת תנאי BSL 4. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון ששלבי יצירת המדרג (gradient) והופעת ה-DNA ghost קשים ללמידה. זאת משום שהשכבת המדרג דורשת יד יציבה ביותר, וה-DNA ghost המשקיע

preparation-of-viral-dna-from-nucleocapsids

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

דרך פשוטה, יעילה וחזקה כדי לסנכרן את המסירה של מרכיבים נגיפיים מרובים בתאי צמח...

פשוט וחזק In vivo ו במבחנה גישה ללימוד הרכבה וירוס

ג'נומיקס וירוס אחד (SVG) הוא שיטה לבודד ולהגביר את הגנום של virons בודד. השעיות נגיפיות של מכלול מעורב מסודרים באמצעות cytometry זרימה לשקופית מיקרוסקופ עם בארות בדידות המכילות agarose, ובכך ללכוד את virion והפחתת גז הגנום במהלך עיבוד במורד הזרם. ההגברה הגנום כולו מושגת באמצעות הגברה עקירה מרובה (מד"א) וכתוצאה מכך חומר גנטי שמתאים לסידור.

בידוד ואנליזה של הגנום virions יחיד באמצעות &#39;נומיקס וירוס אחד &quot;

מקור: .Dembowski, J. A ואחריםטיהור של DNA נגיפי לצורך זיהוי חלבונים נגיפיים ותאיים נלווים. J. Vis. Exp. (2017).סרטון זה מדגים את בידודם של קומפלקסים של חלבון-DNA ויראלי מגרעיני תאים באמצעות כימיית קליק (click chemistry) וטיהור באמצעות חרוזי מגנט. הפרוטוקול כולל סימון של גנומים ויראליים באמצעות נוקלאוטידים שעברו מודיפיקציה של אלקין, ביוטינילציה באמצעות תגובת קליק, וקישור לחרוזי מגנט מצופים בסטראפטווידין. לאחר שטיפה ואלוציה תרמית, הקומפלקסים המטוהרים נאספים, עוברים הקפאה מהירה ומאוחסנים לצורך...

בידוד חלבונים מקומפלקסים של DNA ויראלי-חלבון

מקור: Gao, Y., et al. יצירה והרכבה של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף של נגיף הסינציטיומ של דרכי הנשימה. J. Vis. Exp. (2021)הסרטון מדגים הרכבה in vitro של נוקלאוקפסيدات ספציפיות לנגיף מקומפלקס מטהר של נוקלאופרוטאין-פוספופרוטאין נטול RNA, את טיהורן באמצעות כרומטוגרפיית החרגתו גודל, ואימות של RNA ויראלי באורכו המלא בתוך החלקיקים המורכבים.

שחזור וטיהור במעבדה (In Vitro) של חלקיקים דמויי נוקלאוקפסיד נגיפיים

בסרטון זה, אנו מתארים הליך לביצוע ננו-הזרקה של נגיף RNA חד-גדילי בעל חוש חיובי לזבובי דרוזופילה זכרים בוגרים ולאחר מכן חוקרים את התגובות האנטי-ויראליות שיזמו עקב הזיהום. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז מזהה את הרגולציה של גנים ספציפיים בזבובים הנגועים המצביעים על הפעלת מסלולי תגובה חיסונית, כולל הפרעות RNA ואיתות JAK/STAT.

ננו-הזרקה נגיפית תוך-חזה לחקר אינטראקציות בין וירוס מארח בזבובים בוגרים

כאן, מוצג פרוטוקול ליצירת כרומוזום מלאכותי חיידקי זיהומי המכיל cDNA באורך מלא של ה-RNA הגנומי החיובי של נגיף דלקת המוח היפני. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לבניית cDNA פונקציונלי של נגיפי RNA חיוביים אחרים, מה שהופך אותו לכלי גנומי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של נגיפים.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

אנו מספקים אסטרטגיה חדשה לבידוד תאי שכפול ויראלי (RC) מתאים אנושיים נגועים באדנו-וירוס (Ad). גישה זו מייצגת מערכת נטולת תאים שיכולה לעזור להבהיר את המנגנונים המולקולריים המווסתים את שכפול הגנום הנגיפי וביטויו, כמו גם ויסות האינטראקציות הוויראליות-מארח שהוקמו ב-RC.

בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus

כאן, אנו מציגים פרוטוקול סינתזה חלקיקים דמויי וירוס באמצעות baculovirus או או מערכות ביטוי יונקים, וטיהור ultracentrifugation. גישה להתאמה אישית זה משמשת לזיהוי אנטיגנים נגיפיים כמטרות חיסון בצורה בטוחה וגמישה.

ביטוי וטיהור של חלקיקים דמויי וירוס עבור חיסון

המטרה של פרוטוקול זה היא במיוחד לתייג באופן סלקטיבי לבודד את ה-DNA הנגיפי של תאים נגועים על האפיון של גנום ויראלי הקשורים חלבונים.

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

כאן אנו מציגים גישה חדשה לזיהוי וירוסים עם כפול-גדיל DNA הגנום. אנו משתמשים בשיטות הרגילות כדי לחלץ DNA ו- RNA עלים נגועים ולבצע רצף הדור הבא. כלים Bioinformatic להרכיב רצפים לתוך contigs, לזהות contigs המייצג את הגנום של וירוס והקצה הגנום לקבוצות בטקסונומיה.

שילוב ניתוח של דנ א ב מיצוי Virion גולמי עם הניתוח של RNA של עלים נגועים לגלות הגנום וירוס חדש

לניתוח מכני מעמיק של סינתזת RNA של הנגיף הסינסיטיאלי הנשימתי (RSV), אנו מדווחים על פרוטוקול של ניצול הפוספופרוטאין המלווה (P) לצורך דו-קיום של הנוקליאופרוטאין (N0)נטול ה- RNA להרכבה במבחנה של הגרעינים הספציפיים לנגיף (NCs).

יצירה והרכבה של נוקלאוקפסידים ספציפיים לווירוסים של הנגיף הסינכרוני הנשימתי

למדו שיטה לבידוד DNA ויראלי בטוהר גבוה מנוקלאוקפסידים של הרפס וירוס בתאים נגועים. הפרוטוקול כולל אולטרה-סנטריפוגציה וחילוץ פנול-כלורופורם ליישומים מולקולריים מתקדמים.

ההכנה של ה-DNA ויראלי של Nucleocapsids

גלה סרטונים נוספים