תיוג רטרוגרדי של נוירונים מוטוריים של דרוזופילה באמצעות צבעים ליפופיליים פלואורסצנטיים

התחל עם עובר דרוזופילה מנותח מקובע על שקופית זכוכית עם סרט סביבו.

הנוירונים המוטוריים של הזבוב מסומנים באופן פלואורסצנטי לצורך הדמיה.

בעזרת מיקרוסקופ, דמיינו את העובר ומקמו מיקרופיפטה ליפופילית בצבע ירוק-פלואורסצנטי ליד העובר.

לאחר מכן, עבור למצב פלואורסצנטי ואתר את הקצה האקסונלי של הנוירון המוטורי בצומת העצב-שרירי, היכן שהנוירון המוטורי מתחבר לשריר.

עבור למצב brightfield, צור קשר עם קצה אקסון המטרה עם הפיפטה, שחרר טיפת צבע ולאחר מכן דגירה.

בשל אופיים הליפופילי וסביבתם האקסונלית, הצבעים נכנסים באופן סלקטיבי לקרום העשיר בשומנים של האקסון הממוקד.

עם הזמן, הצבע נע לאחור, נע לאחור לאורך שכבת השומן הדו-שכבתית האקסונלית לעבר הגוף העצבי, ומסמן את ההקרנות העצביות.

הסר את הסרט מהשקופית והנח כיסוי.

התבונן בשקופית תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

נוירון המטרה המסומן בנסיגה מופיע בפלואורסצנטיות ירוקה, ומציג מורפולוגיה והקרנות עצביות מפורטות.

השתמש במחט זכוכית מתחת למיקרוסקופ דיסקציה כדי לגרור את העובר החוצה מקרום הוויטלין מהסרט אל הזכוכית, תוך הקפדה לא לפגוע ברקמות הפנימיות של העובר. לאחר מכן חותכים את קו האמצע של עובר בודד על פני השטח שלו מהקצה האחורי לקדמי. הפוך את רקמות האפיתל מהמרכז והצמד את קצה האפידרמיס על פני מגלשת הזכוכית.

השתמש במחט המחוברת לצינור עם פתח קצה של כ-300 מיקרומטר כדי לשאוב או לנשוף אוויר כדי להסיר את גזעי קנה הנשימה האורכיים הגביים, כמו גם את כל המעיים שנותרו. השתמש ב-4% PFA ו-PBS כדי לקבע את העוברים למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי. לאחר מכן שטפו אותם שלוש פעמים עם PBS.

צבעו את העוברים במיקרוליטר אחד של נוגדן פרוקסידאז נגד חזרת מצומד עם צבע ציאנין 3 ו-200 מיקרוליטר PBS למשך שעה אחת על שייקר המסלול. וחזור על השטיפות ב- PBS. כדי למלא את המיקרופיפטה של ההזרקה, הנח אותה במחזיק הנימים. לאחר מכן, הנח את שקופית הצבע על הבמה והשתמש במיקרומניפולטור כדי למקם אותה מעל השקופית.

לאחר מכן התאם את ה-stage כדי להניח את המיקרופיפטה על הצבע. אסוף את הצבע ואת המיקרופיפטה על ידי הגדרת לחץ ההזרקה בין 200 ל-500 הקטופסקאל, זמן ההזרקה בין 0.1 ל-0.5 שניות ולחץ הפיצוי ל-0 למשך 5 דקות. לאחר איסוף הצבע, הסר את שקופית הצבע והנח את הדגימה על שלב המיקרוסקופ.

לאחר מכן הגדל את לחץ הפיצוי לטווח של 30 עד 60 הקטופסקאל והורד את המיקרופיפטה לתוך הדגימה. השתמש בעדשה האובייקטיבית פי 10 כדי לאתר את העובר וליישר את המיקרופיפטה עם העובר. שנה את עדשת האובייקט לעדשת טבילה במים פי 40, וטבל את העדשה לתוך ה-PBS.

השתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לבדוק את המורפולוגיה העצבית המסומנת על ידי אנטי-HRP Cy3 ולקבוע את מקום ההזרקה. כאשר העובר נמצא בפוקוס, שנו את מיקום המיקרופיפטה כדי ליצור מגע עדין עם קצה האקסון המבוקש. לאחר מכן השתמש במיקרוסקופ שדה בהיר במהלך ההזרקה כדי לראות את טיפת הצבע. זרוק את הצבע בחצי בטן ימין בצומת העצב-שרירי של ACC או RP3 עם DiD או DiO.

השתמש בשלט היד כדי לשחרר את הצבע ולהסיר את המיקרופיפטה. לאחר מכן עברו לאתר ההזרקה הבא. דגרו את הדגימה למשך שעה בטמפרטורת החדר על שייקר אורביטלי לפני ההדמיה. בעזרת מלקחיים עדינים, הסר את הקלטות ממגלשת הזכוכית.

כדי להרכיב את הדגימה, הכינו כיסוי עם כמות קטנה של שומן ואקום בארבע הפינות. הנח אותו בזהירות על הדגימה, הקפד להימנע מבועות אוויר. דחוף כלפי מטה את הכיסוי כדי לכוונן את החלל מהדגימה כדי לאפשר מרחק עבודה בין עדשת האובייקט לשקופית.

הסר את כל ה-PBS העודף עם מגבוני משימות. אטום לחלוטין את שולי הכיסויהחלקה עם לק. צלם פי 10 ופי 100 בהגדלה עם מיקרוסקופ קונפוקלי ועבד את התמונות עם תוכנת ImageJ.