אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 3:38 דק׳ • April 28th, 2025
התחל עם נוירונים היפותלמוסיים ראשוניים של עכבר מסוג פרא ונוקאאוט CCR5 שגודלו על כיסויים מצופים פולי-D-ליזין בצלחת מרובת בארות.
נוירונים אלה מבטאים טרנספורטר גלוקוז מתויג חלבון פלואורסצנטי ירוק-4 (GFP-GLUT4) בציטופלזמה.
העבר את הכיסויים על שקופיות זכוכית ונגב בעדינות את המדיום העודף כדי להבטיח יציבות במהלך רכישת התמונה.
הנח שקופית על שלב המיקרוסקופ דה-קונבולוציה כשהכיסוי פונה כלפי מטה.
דמיין את הנוירונים תחת תאורת שדה בהיר, ואז טפל בהם עם הכימוקין CCL5 והאינסולין ברצף.
עבור לתאורה פלואורסצנטית כדי לזהות נוירוני מטרה המבטאים GFP-GLUT4 ולהתאים את פרמטרי ההדמיה כדי ללכוד תמונות פלואורסצנטיות חיות.
בנוירונים מסוג פרא, אינסולין ו-CCL5 נקשרים לקולטן האינסולין ול-CCR5, בהתאמה, ומפעילים מסלולי איתות במורד הזרם המניעים טרנסלוקציה של ממברנת GFP-GLUT4.
בנוירונים נוקאאוט של CCR5, CCL5 לא מצליח להיקשר, וכתוצאה מכך טרנסלוקציה מופחתת של GFP-GLUT4.
צלם את התמונות והחל אלגוריתם דה-קונבולוציה כדי להפחית אור שאינו ממוקד, ולשפר את בהירות התמונה והרזולוציה.
כדי להכין את התאים להדמיה חיה, הסר בזהירות את הכיסויים עם נוירונים באמצעות מלקחיים והנח אותם על מגלשת הזכוכית בזהירות. לאחר מכן הסר עודפי מדיום עם מגבוני משימה עדינים על ידי קיפולם פעמיים והנחתם בזהירות על הכיסוי מבלי להזיז אותו.
חיוני להסיר כמות עודפת של מד
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים