מיקרוסקופיה דו-פוטונית לחקר משיכה של תהליך מיקרוגליה לתרכובת בפרוסת מוח של עכבר

הניחו פרוסת מוח של עכבר בתא זלוף המכיל aCSF תחת מיקרוסקופ דו-פוטוני.

העכבר מהונדס גנטית לבטא GFP במיקרוגליה, מה שמאפשר מעקב אחר תנועת מיקרוגליה.

אבטח את הפרוסה בעזרת מחזיק.

באמצעות תאורת שדה בהיר, אתר את אזור העניין.

עבור לתאורה פלואורסצנטית כדי לדמיין את המיקרוגליה.

מלאו מיקרופיפטה בתרכובת הבדיקה, הרכיבו אותה על מחזיק מזרק והורידו אותה כדי לגעת בפרוסה.

הפעל מצב הדמיה של שני פוטונים, תוך מיקוד אור קרוב לאינפרא אדום באנרגיה נמוכה לתוך הרקמה.

בנקודת המוקד של הלייזר, שני פוטונים משלבים את האנרגיה שלהם כדי לעורר GFP, ופולטים פלואורסצנטיות.

צלם תמונות במישורי Z מרובים כדי להתמקד בתהליכי המיקרוגליה.

רשמו את הפעילות הבסיסית, ואז הזריקו את התרכובת והמשיכו להקליט.

התרכובת נקשרת לקולטני מיקרוגליה, ומפעילה מסלולי איתות המניעים את התרחבות תהליך המיקרוגליה לעבר מקור התרכובת.

עקוב אחר עליית הקרינה ליד אתר ההזרקה לאורך זמן כדי לעקוב אחר התנועה.

30 דקות לפני תחילת ההקלטה, חבר את המשאבה הפריסטלטית לתא הקלטה מותאם אישית עם זלוף עליון ותחתון לאופטימיזציה של החמצון והכדאיות של פרוסות הרקמה ונקה את כל מערכת הזילוף עם 50 מיליליטר מים טהורים במיוחד. בתום מחזור הניקוי, התחל את הזלוף של תא ההקלטה עם 50 מיליליטר aCSF בכוס זכוכית תחת קרבוגנציה מתמדת והשתמש בפיפטה חד פעמית להעברת פה רחב כדי להעביר את הפרוסה הראשונה להדמיה לכוס כדי להסיר את נייר העדשה.

כאשר החלק שקע לתחתית הכוס, העבירו את החלק לתא ההקלטה ומקמו את מחזיק הפרוסה על הפרוסה כדי למזער את התנועה הנגרמת על ידי זרימת הזילוף. השתמש בתאורת שדה בהיר כדי למקד את אזור העניין במוח בהגדלה של פי 5 עד 10. לאחר מכן השתמש במטרה פי 25 עם עדשת טבילה במים פי 0.35 כדי להתאים את מיקום שדה הצפייה.

השתמש בתאורה פלואורסצנטית כדי לאתר את תאי המיקרוגליה הפלואורסצנטיים ולמלא מחדש את הפיפטה ב-10 מיקרוליטר של aCSF המכיל את התרכובת המעניינת בריכוז הסופי שלה. כוון את הקצה כלפי מטה בניעור עדין כדי להסיר בועות אוויר כלואות בקצה והרכיב את הפיפטה המלאה למחזיק פיפטה המחובר למזרק של 5 מיליליטר, עם בוכנה הממוקמת במצב של 5 מיליליטר ומותקנת על מיקרומניפולטור בעל שלושה צירים.

הורד את הפיפטה בעדינות לכיוון הפרוסה, שלוט והתאם את המטרה בו זמנית, עד שקצה הפיפטה נוגע קלות במשטח הפרוסה. כעת כוונו את הלייזר והעבירו את המיקרוסקופ למצב מולטיפוטון. ודא שהתא מוקרן מכל מקור אור והפעל את הגלאים שאינם נסרקים. הגדר את הרווח והשתמש בטבלת חיפוש עם גבול עליון מקודד צבע כדי למנוע רוויה של הפיקסלים בתמונה.

לאחר מכן התחל להקליט למשך זמן כולל של 30 דקות לפחות, לחץ לאט על בוכנת המזרק ממצב של 5 ל-1 מיליליטר לאחר חמש דקות במשך תקופה של 5 שניות כדי להחיל את התרכובת על הקטע. לניתוח תמונה, בצע תחילה תיקון הקרנת Z וסחיפה עם ImageJ בקובץ המבוקש. לאחר מכן פתח את הקובץ שהשתנה ב-Icy וצייר אזור עניין עגול בקוטר 35 מיקרומטר שבמרכזו אתר ההזרקה.

הפעל את הסרט שוב עם החזר ה-ROI כדי להבטיח שהוא ממוקם היטב. לאחר מכן, השתמש בתוסף Region of interest Intensity Evolution כדי למדוד את העוצמה הממוצעת לאורך זמן באזור העניין ולשמור את התוצאות כקובץ .xls.