הדמיה של הפעלה עצבית בהיפוקמפוס בקטעי מוח של עכבר

התחל עם קטעי מוח של עכבר החושפים את ההיפוקמפוס הגבי העשיר בנוירונים.

הוסף מי חמצן כדי להרוות את פעילות הפרוקסידאז העצבי, ולאחר מכן שטיפה.

טפל עם מאגר חדירה, ולאחר מכן החל מאגר חוסם כדי לחסום כריכה לא ספציפית.

הוסף את הנוגדנים העיקריים ודגר בהתרגשות. נוגדנים אלה נקשרים לחלבוני סמן הפעלה עצביים.

שטפו ומרחו נוגדנים משניים מצומדים לביוטין כדי לקשור את הנוגדנים העיקריים.

שטפו והציגו קומפלקס avidin-biotin-peroxidase שנקשר לביוטין על המצומדים.

שטפו שוב, ואז הוסיפו מצע כרומוגני, שמתחמצן על ידי פרוקסידאז כדי ליצור משקע חום. עצור את התגובה עם PBS.

העבירו את החלקים לשקופית מצופה ג'לטין וייבשו אותם באמצעות ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול. לאחר מכן, נקה את החלקים בקסילן והרכיב אותם.

מקם את השקופית מתחת למיקרוסקופ של שדה בהיר.

תחת תאורת אור, אזורים לא מוכתמים מעבירים אור ונראים בהירים, בעוד שתאי עצב מוכתמים סופגים ומחזירים אור ונראים כהים יותר.

האזור הכהה המובהק מצביע על הפעלה עצבית בתוך ההיפוקמפוס.

העבירו שלושה עד חמישה קטעי היפוקמפוס גביים לכל עכבר לבארות של צלחת מרובת בארות המכילה 500 מיקרוליטר של 0.1 PBS טוחנת לכל באר. שוטפים את החלקים הכלולים בכל באר עם 500 מיקרוליטר של 0.1 PBS מולארי. בצע את כל השטיפות והדגירה בטמפרטורת החדר בתסיסה עדינה, אלא אם צוין אחרת. מתחת למכסה אדים, דגרו את החלקים ב-40% מתנול, 1% מי חמצן ב-0.1 PBS מולארי למשך 20 דקות על מנת להרוות את פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית.

לאחר שלוש שטיפות נוספות ב-0.1 PBS מולארי, יש לחלחל את החלקים על ידי דגירה ב-500 מיקרוליטר של 0.2% Triton X-100 למשך חמש דקות. בזמן שהחלקים מדגרים, הכינו מספיק מאגר חוסם לכל הניסוי. לאחר מכן, הסר את תמיסת החדירות והוסף 100 מיקרוליטר של מאגר החסימה לכל באר. דגרו את החלקים למשך שעה.

לאחר מכן, הסר את המאגר החוסם וכסה את החלקים בנוגדנים ראשוניים קינאז מווסת חוץ-תאי זרחני, מדולל מ-1 עד 500 במאגר חוסם. דגרו את החלקים למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה. למחרת, לאחר שטיפת החלקים שלוש פעמים ב-0.1 PBS מולארי למשך 5 דקות כל אחד, דגרו את החלקים עם נוגדן משני מצומד ביוטין מדולל 1 עד 250 מאגר חוסם למשך שעה בטמפרטורת החדר.

במהלך הדגירה, הכינו את מגיב ה-ABC לפחות 30 דקות לפני השימוש על מנת לאפשר מספיק זמן להיווצרות קומפלקס אבידין וביוטין. לאחר שטיפת החלקים שלוש פעמים נוספות עם 0.1 PBS מולארי, הוסף את מגיב ה- ABC ואפשר לו לדגור עם הדגימה למשך 45 דקות. במהלך הסט הבא של שלוש כביסות ב-PBS, הכן את תמיסת העבודה במכסה האדים בהתאם למפרט היצרן. ציטוט את תמיסת העבודה בצלחת.

לאחר מכן, העבירו חלקים לבארות המכילות את תמיסת העבודה DAB, וסובבו לאט את הצלחת כדי לאפשר חשיפה מקסימלית של החלקים לתמיסה. עקוב אחר תגובת ה-DAB במיקרוסקופ עד שיתפתח אות מתאים תוך כשתיים עד חמש דקות. עצור את התגובה בעוצמת הצבע הרצויה על ידי שטיפת הרקמה ב-0.1 PBS מולארי. לאחר שלוש כביסות נוספות ב-PBS, הרכיבו את החלקים על שקופיות מצופות ג'לטין וייבשו אותם בטמפרטורת החדר למשך שלוש עד ארבע שעות לפחות.

לאחר ייבוש האוויר, העבירו שקופיות במכסה האדים, וייבשו את החלקים על ידי הנחתם ברצף לתמיסות אתנול מדורגות למשך שתי דקות כל אחת. לאחר מכן, נקה את השקופיות ב-100% קסילנים למשך חמש דקות. כסו את השקופיות באמצעות מדיום הרכבה, והשאירו אותן במכסה האדים למשך הלילה לייבוש.

העבירו את השקופיות למיקרוסקופ שדה בהיר המצויד במצלמה בעדשת אובייקט פי 20. רכוש מספר תמונות שדה בהירות מכל קטע בהגדלה של פי 200, המכסות את ההיפוקמפוס הגבי. דמיינו שלושה עד חמישה חלקים מכל חיה.