הדמיית דינמיקת ATP תוך-תאית באמצעות חיישנים מבוססי FRET בפרוסת היפוקמפוס אורגנוטיפית של עכבר

אבטח פרוסת היפוקמפוס אורגנוטיפית של עכבר בתא ניסוי.

הפרוסה מכילה נוירונים ואסטרוציטים מותמרים המבטאים חיישן ATP עם חלבונים פלואורסצנטיים תורמים ומקבלים.

הנח את החדר על במת מיקרוסקופ פלואורסצנטי והחדיר אותו עם ACSF מחומצן.

אפשר לפרוסה להסתגל לתנאי המאגר.

באמצעות נורית שידור, מקד את הפרוסה וזהה את אזור העניין.

עבור למצב פלואורסצנטי ועורר את החלבון הפלואורסצנטי התורם כדי ליזום פליטת פלואורסצנטיות.

עם קשירת ATP, החיישן עובר שינויים קונפורמטיביים, המאפשרים העברת אנרגיה מבוססת פלואורסצנטיות מהתורם למקבל, הפולט פלואורסצנטיות באורך גל ארוך יותר.

השתמש במראה דיכרואית ובמסנני פס פס כדי לבודד ולהפריד בין פליטות תורם ומקבל.

בחר אזור ללא פלואורסצנטיות להפחתת רקע. לאחר מכן, זהו תאי מטרה ורשמו את הקרינה שלהם לאורך זמן.

חשב את יחס ה-FRET כדי לנטר את רמות ה-ATP התוך-תאיות בזמן אמת.

הכן ACSF ניסיוני וקבל pH של 7.4 על ידי בעבוע עם 95% חמצן ו-5% פחמן דו חמצני דרך צינור מוכנס המחובר לאספקת הקרבוגן למשך 30 דקות לפחות. שמור על מי מלח מבעבעים במהלך כל הניסוי. לאחר מכן, הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי של המונוכרומטור.

העבירו את תרבית הפרוסות האורגנוטיפיות לתא הניסוי. הנח רשת על גבי תרבית הפרוסות האורגנוטיפית כשהמסגרת כלפי מטה, לא נוגעת בתרבות, והחוטים כלפי מעלה, נוגעים בקרום. הנח את החדר על במת המיקרוסקופ וחבר אותו ל