הדמיית שני פוטונים in vivo של רשתית העכבר

קח עכבר טרנסגני מורדם כשראשו מאובטח בזווית על מחזיק להדמיה in vivo של רשתית העכבר.

הרשתית מכילה תאי גנגליון רשתית, או RGCs, המבטאים חלבון מתויג פלואורופור.

מרחו חומר סיכה לעיניים והניחו כיסוי על העין.

תחת מיקרוסקופ, מאירים באופן אחיד את הרשתית כדי לעורר את החלבונים הפלואורסצנטיים ב-RGCs.

באמצעות הקרינה הנפלטת, קבל תצוגה רחבה של RGCs במישור המוקד ו-RGCs שאינם ממוקדים.

עבור למצב הדמיה של שני פוטונים, תוך מיקוד אור קרוב לאינפרא אדום באנרגיה נמוכה לתוך שכבת ה-RGC.

בנקודת המוקד, האנרגיה המשולבת משני פוטונים מעוררת את הפלואורופור, אשר לאחר מכן משחרר אנרגיה כפלואורסצנטיות.

מכיוון שהעירור מוגבל לנקודה אחת, הקרינה ממישורי מוקד אחרים ממוזערת.

צלם תמונות במישורי מוקד מרובים לאורך ציר z כדי לדמות את שכבת ה-RGC כולה.

מרחו טיפות עיניים על שתי עיני העכבר. סובב את הזרוע הראשית של מחזיק הראש עד שהאישון של עין אחת מכוון בקו אחד עם נתיב האור, והנח כיסוי מספר 1.5 לתוך מחזיק המסנן הקומפקטי. לאחר אבטחת המחזיק לשלב המיקרוסקופ, הורד את הכיסוי עד שהוא יוצר קשר עם חומר הסיכה i-gel מבלי לגעת בקרנית. והתאם את ה-stage בממד xy ואת מיקום z האובייקטיבי עד שנורית עירור השדה הרחב תכסה את הקרנית במלואה.

השתמש בעינית כדי להמשיך לכוונן את מיקום z, עד שהתאים הפלואורסצנטיים או המבנים ברשתית נכנסים למיקוד, והגדל את מאיר האפיפלואורסצנטי לפי הצורך כדי לפתור תאים בודדים או מבנים מעניינים. כוונון עדין של יישור הרשתית עם נתיב אור ההדמיה. כוונן את זווית הראש עד שתתרחש רק התרחבות או התכווצות של האור שאינו ממוקד בעת שינוי מישור המוקד, תוך מזעור עיוותי xy.

לאחר מכן כבה את תאורת האפיפלואורסצנטי וסגור את תריס התאורה. להדמיה של שני פוטונים, עקוב אחר כל פרוטוקולי בטיחות הלייזר המוסדיים. כבה וכסה את כל האור הסביבתי והעבר את נתיב אור העירור ללייזר ואת נתיב אור הפליטה ל-PMT.

בתוכנת רכישת התמונות, הגדר את גודל המסגרת ל-512 על 512 ואת ממוצע המסגרת ל-3. הגדר את צעדי ה-z כך שיתחילו בחלק העליון של הערימה ויתקדמו כלפי מטה, תוך מזעור הפעלת הלייזר של שני הפוטונים של קולטני האור. הפעל והפעל את ה-PMT, והתאם את המתח ל-680 וולט.

הפעל את תריסי ההדמיה והפליטה. התחל תצוגה מקדימה של תמונה חיה של רקמת המטרה החל מעוצמת לייזר של 1%, והתאם אוטומטית את בהירות התצוגה כדי להמחיש את התאים או המבנים המעניינים. אם רקמת המטרה עמומה או לא ברורה, הגדל את אחוז הספק הלייזר עד שהמבנים נראים מבלי לעלות על 45 מילי-וואט.

תמרן את שלב המיקרוסקופ בכיוון xy כדי להתרכז באזור הדמיה רצוי, ונווט למישור z, כאשר המבנים המעניינים ממוקדים. עבור ניסוי כרוני של זמן-lapse, פתח תמונה שהושגה בעבר כדי להשתמש בה כהתייחסות לתאים המעניינים, תוך הקפדה שזווית ההדמיה בתמונה הנוכחית תהיה דומה לזו של התמונות הקודמות. לאחר מכן נווט למישורי z העליונים והתחתונים ביותר המעניינים כדי להגדיר את גבולות z של ערימת ההדמיה ולרכוש את התמונה.