אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מדעי המוח
0 צפיות • 2:48 דק׳ • May 29th, 2025
התחל עם מערך מיקרוסקופ פלואורסצנטי המכיל דיאפרגמה משותקת עם עצבים פרניים מעכבר טרנסגני.
הצומת העצבי-שרירי של הסרעפת מורכב מנוירון מוטורי, סיב שריר ותאי שוואן המכילים קולטני אצטילכולין ותעלות סידן.
לתאים אלה יש קולטני אצטילכולין בעלי תווית פלואורסצנטית ומבטאים מדדי סידן תוך תאיים.
מפצל תמונה המחובר להתקנה מאפשר הדמיה בו-זמנית של שני האותות הפלואורסצנטיים.
העצב הפרני ממוקם באלקטרודת יניקה כדי לספק גירוי חשמלי.
תחת המיקרוסקופ הקרינה, דמיין קולטני אצטילכולין כדי לזהות צומת עצבי-שרירי.
כדי להגדיר פלואורסצנטיות מקסימלית בסיסית, הוסף תמיסת אשלגן כלורי כדי לבצע דה-פולריזציה של קרום התא באופן זמני. זה מפעיל זרם סידן תוך תאי, וגורם לעלייה בקרינה של האינדיקטורים.
כוונן את הגדרות הבהירות כדי למנוע רוויה יתר של אות הקרינה.
לאחר רפולריזציה, הפעל גירויים חשמליים כדי להפעיל זרם סידן לתא ורשום את השינוי בקרינה התוך תאית בקצב פריימים גבוה.
בהגדלה של פי 20, אתר את רצועת לוחית הקצה במרכז השריר על ידי חיפוש צמתים עצביים-שריריים עם תווית פלואורסצנטית אלפא-בונגרוטוקסין תחת עירור אור צהוב ירוק. עבור לעירור אור כחול כדי לדמות תגובות סידן בתאי שריר, נוירונים מוטוריים או שוואן. בדוגמה זו, GCaMP 3 מתבטא בתאי שריר.
אם תרצה, הגדר את מפצל התמונה עם מסנני פס פס ומסנן קצה יחיד דיכרואי להדמיית אורך גל כפול. בצע ניסויים עם סרגל הבהירות בסרגל טבלת החיפוש, המוגדר ל-110% מהרמה שבה אינדיקטור הסידן המקודד גנטית המבטא רקמה מציג רוויה בהגדלה פי 20, ללא binning בתגובה לאשלגן כלורי.
הקלט ב-20 פריימים לשנייה כדי לא לפספס אירועים מהירים. עורר עם 1 עד 45 שניות של גירוי עצבי של 20 עד 40 הרץ על ידי העברת רכבת של דחפים באמצעות אלקטרודת יניקה. ולאסוף תגובות סידן פלואורסצנטיות דינמיות בתת-סוג תא אחד, יחד עם אות הצומת העצבי-שרירי הסטטי אלפא-בונגרוטוקסין.