מיקרוסקופיה דו-פוטונית של אסטרוציטים ונוירונים מעוררים ברקמת היפוקמפוס של עכבר מנוקה

התחל עם רקמת היפוקמפוס של עכבר שהופכת לשקופה אופטית על ידי הסרת שומנים. הרקמה מוטמעת ברשת הידרוג'ל לייצוב ביומולקולות ולשימור מבנים תאיים.

הרקמה מכילה אסטרוציטים המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום ונוירונים מעוררים המבטאים חלבון גרעיני ירוק, המאפשרים הדמיה מובחנת.

הניחו את הרקמה על שקופית וצרו תא באמצעות דבק חם, תוך השארת רווח קטן.

מרחו תמיסה תואמת מקדם שבירה כדי להעניק לחות לרקמה ולמנוע בועות, ולאחר מכן אטמו עם כיסוי.

מלאו את התא בתמיסה תואמת מקדם שבירה כדי להפחית את פיזור האור ולסגור את הפער.

דמיינו את הרקמה באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני.

אור קרוב לאינפרא אדום מעורר את החלבונים הפלואורסצנטיים האדומים והירוקים במישור המוקד, ומאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה עם נזק אור מינימלי. פליטות פלואורסצנטיות מזוהות בנפרד, וחושפות בבירור את הקרבה המרחבית בין אסטרוציטים לגרעיני הנוירונים המעוררים.

ראשית, הנח את הדגימה באמצע השקופית. בעזרת דבק חם יוצרים קירות בשולי המגלשה, כמעט בגובה הרקמה. הקפידו להשאיר פער קטן באחת הפינות. כאשר שכבת הדבק החם מתקרבת לגובה פרוסת המוח, יש למרוח טיפה אחת עד שתיים של תמיסת התאמת מקדם השבירה על הדגימה כדי להרטיב את המשטח העליון ולמנוע היווצרות בועות.

בזמן שהדבק החם עדיין נוזלי, אטמו את החלק העליון בעזרת כיסוי, והניחו אותו בצורה אחידה ככל האפשר. לאחר מכן, מלאו את החדר בתמיסת התאמת מקדם השבירה. סגור את הפער עם דבק חם. אם קירות הדבק החם משתרעים מעבר לגבולות השקופית, חותכים את הקצוות המתארכים. אם משתמשים במטרת טבילה בשמן להדמיה, הוסף עוד שניים עד שלושה מילימטרים של דבק לקירות שמעל הכיסוי כדי לשמור על תמיסת הטבילה. לאחר פרוטוקול זה, רקמת המוח תתנקה.