כימות נוירונים חדשים שנוצרו ברקמת מוח של חולדה באמצעות טכניקת המפרק האופטי

קחו פרוסות מוח בהיפוקמפוס מחולדה שהוזרקה לברומודוקסיורידין, או BrdU, אנלוגי נוקלאוזיד של תימידין.

BrdU משתלב ב-DNA במהלך חלוקת התאים, ומסמן נוירונים חדשים שנוצרו בתוך הפיתול המשונן, אזור לנוירוגנזה.

דגירה עם חומר מחמצן כדי לנטרל אנזימי פרוקסידאז אנדוגניים.

טפל בחומצה כדי לנטרל את ה-DNA ולחשוף את BrdU, ואז לנטרל את החומצה.

דגירה עם חומר ניקוי כדי לחלחל את ממברנות התאים ותמיסה חוסמת כדי להסוות אתרי קשירה לא ספציפיים.

דגירה עם נוגדנים ראשוניים המכוונים ל-BrdU, ואחריהם נוגדנים משניים מתויגים פרוקסידאז ספציפיים לנוגדנים הראשוניים.

הכנס מצע כרומוגני וחומר מחמצן, המאפשר לפרוקסידאז להמיר את המצע לשאריות צבעוניות.

הרכיבו את הרקמה וצבעו בצבע קושר חומצת גרעין.

ייבשו את הרקמה ולאחר מכן טפלו בה כדי להגביר את השקיפות.

במיקרוסקופ, זהה את הפיתול המשונן.

באמצעות טכניקת המפרק האופטי, נתח מספר מישורים על פני עובי הרקמה כדי לכמת נוירונים המסומנים ב-BrdU.

כאשר מוכנים להתחיל, צביעה חיסונית, אפשרו לחלקים להגיע לטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש במכחול כדי להעביר כל חלק חמישי מסדרה של חלקי היפוקמפוס לרשתות צביעה של 25 בארות המונחות בצלחות פטרי מלאות ב-PBS. צריכים להיות 8 עד 12 חלקים לכל היפוקמפוס לצביעה. העבירו את רשתות הצביעה, המכילות את החלקים, לכלי זכוכית תואמים, המכילים PBS, ושטפו את החלקים פעמיים במשך 10 דקות ב-PBS.

לאחר מכן, דגרו במי חמצן 3% למשך 20 דקות. לאחר הכביסה, העבירו את החלקים דרך שלוש תמיסות חומצה הידרוכלורית. לאחר מכן, יש לנטרל 0.1 נתרן טטרבוראט מולארי בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

לאחר שלוש דגירות של 10 דקות בהחלפת מאגר כביסה, העבירו את החלקים לתמיסת חסימה למשך שעה בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, דגרו את החלקים באנטי-BrdU של עכבר, מדולל 1 עד 100 בתמיסת חסימה למשך 48 שעות ב-4 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה הראשונית של הנוגדנים, יש לשטוף שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת במאגר כביסה, ואז לדגור במשך 48 שעות בחזרת פרוקסידאז, מדולל 1 עד 10 במאגר כביסה. 48 שעות לאחר מכן, העבירו את החלקים ל-PBS למשך 10 דקות, וחזרו על הפעולה בסך הכל חמש כביסות. לאחר הכביסה, העבירו את החלקים לתמיסת DAB למשך שבע דקות. לאחר מכן, העבירו לתמיסת DAB המכילה 0.02% מי חמצן למשך 10 דקות.

לאחר סדרת כביסות, הרכיב את החלקים בסדר מספרי על שקופיות מיקרוסקופ. יש להניח לייבוש למשך כ-30 דקות. לאחר מכן, יבש את הדגימות באוויר על ידי הנחתן במתלה שקופיות. לאחר מכן, הרטיב את הדגימות למשך 10 דקות בכלי צביעת שקופיות המכיל מים מזוקקים.

לאחר מכן, העבירו את השקופיות ל-0.02% סגול קריסטל במים מזוקקים למשך 15 דקות. לאחר חזרה על כתם הסגול הקריסטלי, יש להרטיב את החלקים דרך סדרת אתנול. לאחר מכן, נקה את החלקים בקסילן פעמיים למשך 15 דקות בכל פעם. לבסוף, הוסף מדיום הרכבה לייבוש מהיר, וכסה את השקופיות.

לאחר 24 שעות ניתן להשתמש בשקופיות למיקרוסקופיה. התחל בבדיקת עובי הרקמה על ידי הנחת השקופיות תחילה על הבמה הממונעת של המיקרוסקופ, ולאחר מכן פתיחת תוכנת הסטריאולוגית. תוחם את אזור העניין באמצעות יעד הגדלה נמוך לפני שינוי ליעד טבילת שמן פי 100.

לאחר מכן, בחר נקודה ספציפית במסגרת החשבונאית, לדוגמה, אזור הסמוך לפינה, ואתר את החלק העליון של המקטע על-ידי תנועה לאורך מישור המוקד עד שתכונה כלשהי של המקטע תופיע במוקד. רשום את מיקום z זה כ-0. לאחר מכן, הזיזו את מישור המוקד כלפי מטה דרך הרקמה עד שרמת ה-z האחרונה של הרקמה תהיה בפוקוס, ואז סמנו את המיקום הזה. עובי הרקמה המקומי מוגדר מ-0 עד לנקודת קצה זו, וניתן לקרוא אותו על ציר ה-z.

רשום את עובי הרקמה. עובי הרקמה נמדד במספר מקומות באזור העניין. גובה הדיסקטור ואזורי השמירה, גודל הספירה, מסגרת אורך המדרגה וההגדלה הסופית נקבעים במחקר פיילוט. כעת, אתם יכולים להתחיל לספור את תאי העצב החיוביים ל-BrdU, בדרך כלל בהגדלה סופית של פי 2,000 עד פי 3,000, באמצעות שמן פי 60, או מטרת שמן פי 100, וצמצם מספרי גבוה.

זהה נוירונים חיוביים ל-BrdU בכל מסגרת ספירה, אך אל תספור את אלה שנוגעים בקו ההדרה האדום. ספרו את הנוירונים החיוביים ל-BrdU הנוגעים בקו ההכללה הירוק, ואת אלה שנופלים בגבולות מסגרת הספירה. ספור נוירונים חיוביים ל-BrdU רק כאשר תכונת העניין מזוהה בבירור בגובה הדיסקטור. תאי העצב הנראים למחצה שמוצגים כאן אינם נספרים.