כימות נוירונים חדשים שנוצרו ברקמת מוח של חולדה באמצעות טכניקת המפרק האופטי

קחו פרוסות מוח בהיפוקמפוס מחולדה שהוזרקה לברומודוקסיורידין, או BrdU, אנלוגי נוקלאוזיד של תימידין.

BrdU משתלב ב-DNA במהלך חלוקת התאים, ומסמן נוירונים חדשים שנוצרו בתוך הפיתול המשונן, אזור לנוירוגנזה.

דגירה עם חומר מחמצן כדי לנטרל אנזימי פרוקסידאז אנדוגניים.

טפל בחומצה כדי לנטרל את ה-DNA ולחשוף את BrdU, ואז לנטרל את החומצה.

דגירה עם חומר ניקוי כדי לחלחל את ממברנות התאים ותמיסה חוסמת כדי להסוות אתרי קשירה לא ספציפיים.

דגירה עם נוגדנים ראשוניים המכוונים ל-BrdU, ואחריהם נוגדנים משניים מתויגים פרוקסידאז ספציפיים לנוגדנים הראשוניים.

הכנס מצע כרומוגני וחומר מחמצן, המאפשר לפרוקסידאז להמיר את המצע לשאריות צבעוניות.

הרכיבו את הרקמה וצבעו בצבע קושר חומצת גרעין.

ייבשו את הרקמה ולאחר מכן טפלו בה כדי להגביר את השקיפות.

במיקרוסקופ, זהה את הפיתול המשונן.

באמצעות טכניקת המפרק האופטי, נתח מספר מישורים על פני עובי הרקמה כדי לכמת נוירונים המסומנים ב-BrdU.

כאשר מוכנים להתחיל, צביעה חיסונית, אפשרו לחלקים להגיע לטמפרטורת החדר. לאחר מכן השתמש במכחול כדי להעביר כל חלק חמישי מסדרה של חלקי היפוקמפוס לרשתות צביעה של 25 בארות המונחות בצלחות פטרי מלאות ב-PBS. צריכים להיות 8 עד 12 חלקים לכל היפוקמפוס לצביעה. העבירו את רשתות הצביעה, המכילות את החלקים, לכלי זכוכית תואמים, המכילים PBS, ושטפו את החלקים פעמיים במשך 10 דקות ב-P