הדמיית סידן של פעילות נוירונים מעיים וגליה במקלעת מיאנטרית של עכבר

קחו תא הדמיה המכיל רקמת מקלעת מיאנטרית של עכבר משותק, המאכלס מקלעות גנגליון המורכבות מרשתות של נוירונים מעיים ותאי גליה.

תאים אלה מסומנים במחוון סידן שזוהר עם קשירת סידן.

לאחר מכן, הנח את החדר על במת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חדרו את החדר עם מאגר מחומם מראש המכיל מעכבים לדיכוי התכווצויות שרירים במהלך ההדמיה.

בעזרת מיקרוסקופ, זהה אזורים גנגליוניים בריאים המציגים פלואורסצנטיות אחידה.

רכוש תמונות פלואורסצנטיות כדי למדוד את הפעילות הבסיסית, תוך מתן התייחסות לרמות הסידן התוך תאי.

לחלחל את הרקמה עם אגוניסט קולטן כדי להפעיל קולטנים עצביים, מה שמפעיל זרם סידן תוך תאי ועלייה בעוצמת הקרינה.

הפעלה עצבית מגרה בעקיפין את תאי הגליה שמסביב, מה שמוביל לזרם סידן ולעלייה לאחר מכן בקרינה.

צלם תמונות פלואורסצנטיות בזמן-lapse כדי למדוד שינויים בעוצמת הקרינה, המצביעים על דינמיקת סידן ופעילות איתות הן בתאי עצב והן בתאי גליה ביחס לרמות הבסיס.

במהלך הדגירה, הכינו מאגר קרב'ס מותאם בהתאם להוראות בחלק הכתוב של הפרוטוקול, והוסיפו 3 ניקרדיפין מיקרו-מולרי ו-1 סקופולמין מיקרו-מולרי כדי לעכב את התכווצויות השרירים במהלך סידן 2 בתוספת הדמיה בדיסקציה שלמה. מקם את תא ההקלטה מתחת למיקרוסקופ הפלואורסצנטי, ובאמצעות מערכת זלוף זרימת כבידה עם מאגרי מזרק מחוממים מרובים, קבע קצב זלוף רציף של 2 עד 3 מיליליטר לדקה של 37 מעלות צלזיוס קרב. הקפד למנוע היווצרות בועות אוויר בשניהם ובקו היניקה המחובר למלכודת ואקום. הבא את המקלעת הרצויה למיקוד תחת תאורת שדה בהיר. הימנע מחשיפת יתר של הרקמה, שעלולה להוביל להלבנת פוטו.

בדוק את העמסת הפלואורופור בתוך הגרעינים ובחר גנגליונים בריאים להדמיה. גנגליונים פגומים לא בריאים יציגו אוטופלואורסצנטיות או מורפולוגיה מנוקבת ואין להשתמש בהם להדמיה. לאחר בחירת גנגליון, הפנה את נתיב האור למצלמה וקבל תמונה חיה עם תוכנת רכישת תמונה. ודא שהגנגליון נמצא בפוקוס והגדר את קצב רכישת התמונה וזמני החשיפה.

שיעורי וזמני רכישת התמונות ישתנו בהתאם לאירועים שהחוקרים רוצים לתעד. עבור רוב הניסויים, תמונות נרכשות באופן מסורתי ב-0.5 עד 1 הרץ עבור תאי גליה, ועד 2 עד 10 הרץ עבור נוירונים, מכיוון שחולפי סידן גליאליים אינם מהירים כמו נוירונים חולפים של סידן.

התחל את ההקלטה וקבע את הפעילות הפיזיולוגית הבסיסית של הגנגליון הנבחר בהיעדר גירויים ניסיוניים למשך 30 שניות. לאחר מכן יש למרוח תרופות מעניינות שחוממו מראש, כגון אגוניסטים ואנטגוניסטים של קולטנים, תוך שימוש במערכת הזלוף של זרימת הכבידה בקצב של 2 עד 3 מיליליטר לדקה על פי פרוטוקול אופטימלי לתרופה שלך. עצור את ההקלטה וצפה בסרטון דולג הזמן של הניסוי.

בחר בקפידה את אזורי העניין, או החזר ההשקעה, באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה.

לבסוף, השתמש בתוכנת הדמיה מתאימה כדי לנרמל ולהשוות את עוצמת הקרינה של אזורי עניין מול ערך הבסיס הראשוני שלה. שינויים בקרינה מנורמלת עומדים ביחס ישר לשינויים בסידן.