הדמיית סידן במבחנה בתרביות היפוקמפוס של חולדות לטווח קצר וארוך

קחו תרבית עצבית בהיפוקמפוס לטווח קצר המייצגת נוירונים צעירים ותרבית ארוכת טווח המייצגת נוירונים מזדקנים.

נוירונים מזדקנים מציגים צפיפות גבוהה יותר של תעלות סידן מגודרות מתח מסוג L, או L-VGCCs, שנשארות פתוחות למשך זמן ארוך יותר עם דה-פולריזציה של הממברנה.

דגרו עם מחוון סידן פלואורסצנטי שמתפזר לתוך התאים, ואז שטפו כדי להסיר עודפי צבע.

הנח את התרביות בתא זלוף תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

הציגו תמיסה המכילה נוירוטרנסמיטורים הנקשרים לקולטנים על הנוירונים, גורמים לזרם יוני נתרן ומעוררים דפולריזציה של הממברנה.

הדפולריזציה מפעילה את ה-L-VGCCs, ומאפשרת זרימת סידן לציטופלזמה.

בתרבית ארוכת טווח, הצפיפות הגבוהה יותר והפתיחה הממושכת של L-VGCCs מובילים לעומס יתר של סידן, סימן היכר של הזדקנות עצבית.

קשירת סידן לאינדיקטור יוצרת פלואורסצנטיות, כאשר נוירונים מזדקנים מציגים עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה יותר, המשקפת רמות סידן תוך תאיות מוגברות בעת גירוי.

בהליך זה, דגרו את התאים עם Fura2-AM למשך 60 דקות בטמפרטורת החדר בחושך, ולאחר מכן העבירו את הכיסויים לתא הזלוף. לאחר מכן, הנח את תא הזלוף עם הכיסוי במחזיק על המיקרוסקופ ההפוך. בחר את השדה המיקרוסקופי והחדיר את התאים ברציפות עם HBS מחומם מראש.

לאחר מכן, האירו את התאים ב-340 ו-380 ננומטר בסופו של דבר, ולאחר מכן הקליטו את האור הנפלט ב-520 ננומטר כל 5 עד 10 שניות עם מצלמת פלואורסצנטיות, המסוננת על ידי מראה דיכרואית Fura-2. לנתח את התמונות הפלואורסצנטיות המוקלטות. ראשית, פתח את קובץ הניסוי.

באמצעות תוכנת AquaCosmos, לחץ על יחס ובחר את טווח היחס הרצוי. חשב את יחס הפיקסל לפי פיקסל בתמונות המתקבלות על מנת לקבל רצף של תמונות יחס. לאחר מכן הפחיתו את הרקע על ידי כוונון כפתור תאורת הרקע. לאחר מכן, לחץ על התחל חישוב. לאחר מכן, לחץ על כפתור רצף כל הזמנים ומחק את החזר ה-ROI העתיק.

לניתוח כמותי של תאים בודדים, קבע החזר ROI חדש או החזר ROI המתאים לנוירונים הבודדים. כדי לשרטט גרף של ההקלטות הבודדות, ייצא את ערכי הקרינה היחסיים המתאימים לכל החזר ROI לתוכנית מעבדת המקור על ידי לחיצה על גרף. לאחר מכן לחץ על חשב ושמור את קובץ ה-TXT. לאחר מכן, בצע את החישוב המתאים להערכת גודל העלייה ביחס הקרינה בתגובה לכל גירוי.