שימוש ברפלקטומטריה ספקטרלית לקביעת קוטר אקסון מיאליני בפרוסת מוח קבועה של עכבר

קח מיקרוסקופ קונפוקלי היפרספקטרלי עם מקור לייזר מיוצב המוגדר לטווח ספקטרלי רחב כדי לפענח את ננו-מבנה מעטפת המיאלין של רקמת המוח.

השתמשו במראה ייחוס כדי ללכוד את ספקטרום ההשתקפות של קו הבסיס. הסר את המראה ורכוש ספקטרום אופסט כהה לתיקון רעשי גלאי.

להעביר תא עם קטע רקמת מוח קבוע לשלב המיקרוסקופ.

יישר את מישור המוקד לאזור הרקמה המבוקש, תוך הקפדה על עומק מספיק כדי למזער הפרעות מממשק רקמת הזכוכית.

אור לייזר מופנה אל מעטפת המיאלין הרב-שכבתית של האקסונים.

כאשר האור מקיים אינטראקציה עם המיאלין, מתרחשות השתקפויות חלקיות בממשקי השכבות, ומייצרות דפוסי התאבכות עקב עובי שכבות משתנה ומקדמי שבירה.

רכוש תמונות ספקטרליות של דפוסי התאבכות אלה.

לאחר תיקון בסיס וניתוח אותות, ספקטרום ההחזר חושף את מחזוריות מספר הגל, ומאפשר קביעת קוטר אקסון מיאליני.

התקן מראת ייחוס על המיקרוסקופ stage, כאשר המשטח פונה לעדשת האובייקטיב. אם לא קל לשים את המראה על במת המיקרוסקופ, הדביקו מראה על הצלחת השטוחה. כוונן את המיקרוסקופtagה כדי ליישר את מישור המוקד למשטח המראה. לאחר מכן, כוונן את רווח ה-PMT ואת עוצמת הלייזר, בהתחשב בטווח הדינמי של הגלאי.

תחת פסאודו-צבע, בדוק שאין רוויה בכל טווח אורכי הגל. אם נצפתה רוויה, הורד את עוצמת הלייזר. לאחר מכן, הפעל את רכישת סריקת הלמבדה. הסר את המראה מהבמה, וחזור על אותה רכישה ללא דגימה על מנת לקבל את ההתייחסות הכהה. לאחר מכן, שמור את הנתונים בתבנית TIFF מרובת ערימות.

כדי לבצע רכישת תמונת SpeRe, הנח את הרקמה המותקנת על שלב המיקרוסקופ. כדי ליישר בערך את הרקמה למישור המוקד של עדשת האובייקט, דרך עינית, השתמש במצב פלואורסצנטי בשדה רחב. כאשר הסריקה החיה מופעלת, שלוט בשלב המיקרוסקופ כדי ליישר את מישור המוקד לאזור העניין ברקמה. כדי למנוע רעשי רקע מהחלקת הכיסוי, בחר אזור יעד בעומק של לפחות 15 מיקרומטר מממשק רקמת הזכוכית.

רכוש את ערימת התמונות הספקטרליות עבור אזור היעד באמצעות אותו הליך שהודגם קודם לכן בסרטון זה. לאחר מכן, שמור את הנתונים עבור הרקמה וההיסט הכהה בפורמט TIFF מרובה ערימות. כדי לעבד את התמונות ב-ImageJ, פתח את הנתונים הספקטרליים עבור מראת הייחוס ורקמת המוח.

בחר את ההחזר על ההשקעה עבור ערימות התמונות שנפתחו, את האזור המרכזי עבור מראת הייחוס ואת המקטע של סיב אקסון עבור רקמת המוח. לאחר מכן, הפעל תמונה, ערימות, מתווה פרופיל ציר z כדי לרכוש את הספקטרום הגולמי עבור החזר ה-ROI שנבחר.

סיבי האקסון עשויים להיות הטרוגניים מבחינה מבנית לאורכם, ולכן מומלץ לבחור את ה-ROI על מקטע אקסון קטן, בדרך כלל פחות מ-5 מיקרומטר, כדי למזער חפצי נפח חלקיים.

פתח את נתוני ההיסט הכהים, אחד שנלקח עבור מראת הייחוס, והשני נלקח עבור רקמת המוח, ושרטט את פרופיל ציר ה-z כפי שהודגם זה עתה. לאחר מכן, השתמש באפשרויות ההעתקה וההדבקה כדי לשמור את כל האפשרויות שנרכשו.