ניתוח תאים חיסוניים ברקמות עצבים של עכברים באמצעות ציטומטריית זרימה

קח תאים שבודדו מעצבים סיאטיים של עכברים וגרעיני שורש גב או DRGs.

דגירה עם נוגדנים מתויגים פלואורופור כנגד CD45 ו-CD11b, ועם נוגדנים מתויגים ביוטין כנגד MHC Class II, כדי לסמן תאים חיסוניים.

דגירה עם סטרפטווידין מתויג פלואורופור שנקשר לביוטין.

טפל עם קיבוע לייצוב המבנה התאי.

הציגו מאגר חדירות עם כתם DNA פלואורסצנטי כדי לחלחל ממברנות ולתייג את הגרעינים.

בעזרת ציטומטר זרימה, העבירו את התאים דרך קרן הלייזר כדי להעריך את המאפיינים האופטיים והפלואורסצנטיים.

הסר אגרגטים עם פלואורסצנטיות DNA גבוהה יותר כדי לבודד תאים בודדים ולזהות את הקרינה מהסמנים.

לזהות תאים המבטאים CD45, סמן אופייני לתאי חיסון, המאשר את נוכחותם.

רוב התאים החיוביים ל-CD45 ב-DRG מבטאים CD11b ו-MHC Class II, מה שמעיד על תאים דמויי מיקרוגליה, שנעדרים בעצבים הסיאטיים.

טכניקה זו משלימה הדמיה לניתוח הטרוגניות של תאי חיסון בתוך רקמות עצבים.

במחשב, בחר את הערוצים המתאימים לזיהוי הפלואורופורים המעניינים, את קצב הזרימה המתאים לדגימות ואת המספר הכולל של האירועים שיש לאסוף לכל דגימה. מספר האירועים המינימלי צריך להיות מיליון.

לאחר מכן, צור תרשימי פיזור תחת גליון עבודה גלובלי של פיזור הצד A לעומת הפיזור הקדמי A, כמו גם עבור כל פלואורופור מעניין לעומת הפיזור הקדמי A. כמו כן, צור תצוגה סטטיסטית שתציג את מספר האירועים ואת עוצמת הקרינה הממוצעת עבור הפלואורופורים שנבחרו.

קבע את שער האב P1 בהתבסס על תרשים הפיזור מפקדי צביעה של DAPI בלבד. צרף את הדגימה לזרימה ציטומטריה ולחץ על רכוש. התבונן בתרשים DAPI לעומת FSC, והפחת את המתח של ערוץ ה-DNA Pacific Blue עד שאוכלוסיית ה-DAPI-plus תהיה גלויה. בעזרת כלי שער המלבן, צייר תיבה סביב אוכלוסיית DAPI-plus. זה מייצג את שער P1. בחר את תרשימי הפיזור עבור כל אחד מהפלואורופורים והצג רק את אירועי DAPI-plus. זה מייצג את הקרינה ברקע עבור כל אחד מהפלואורופורים.

בעזרת כלי שער המלבן, צייר תיבה בעלילות הפיזור עבור כל אחד מהפלואורופורים, החל מ-103 על ציר ה-y. שער זה מייצג את האזור שבו יש למצוא אירועים חיוביים עבור כל אחד מהסמנים המוצהרים. התאם את המתח עבור כל אחד מהפלואורופורים באמצעות בקרות הצביעה של DAPI בלבד. צרף את הדגימה לזרימה ציטומטריה ולחץ על רכוש.

התבונן במיקום אוכלוסיית ה-DAPI-plus עבור כל אחד מהפלואורופורים, והתאם את המתחים המתאימים כך שהאוכלוסיות ייפלו מחוץ לשער המלבן. לאחר הגדרת ציטומטר הזרימה, הפעל את הדגימות וייצא את קבצי הפיזור קדימה להמשך ניתוח.