אבלציה סלקטיבית של לייזר חד-נוירון בזחל דג זברה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

קח תמיסת אגרוז שחוממה מראש המכילה זחל דג זברה טרנסגני מורדם המבטא חלבון פלואורסצנטי בנוירונים מוטוריים בעמוד השדרה.

העבירו את הזחל לצלחת זכוכית עם טבעת אגרוז.

בעזרת מיקרוסקופ, סובב את הזחל על צידו. לאחר מכן, אפשר לאגרוז להתמצק, ומשתק את הזחל.

הוסף חוצץ המכיל חומר הרדמה לשמירה על ההרדמה.

הנח את הצלחת על שלב המיקרוסקופ הקונפוקלי והשתמש בהדמיית שדה בהיר כדי לאתר את אזור חוט השדרה הגבי.

עבור למצב פלואורסצנטי כדי להמחיש נוירונים מוטוריים פלואורסצנטיים.

קבע את מישור ה-z המרכזי של סומה התא למיקוד אבלציה מדויק.

הגדר פרמטרי הדמיה לרכישה ברזולוציה גבוהה תוך מזעור נזקי האור.

לאחר שמישור ה-z הרצוי נמצא במיקוד, בצע אבלציה באזור נוירוני המטרה באמצעות לייזר אולטרה סגול ממוקד.

אנרגיית לייזר משבשת מבנים תאיים, גורמת לאובדן פלואורסצנטי ולמוות של תאים. אובדן פלואורסצנטי בלתי הפיך מאשר אבלציה מדויקת מבלי להשפיע על התאים שמסביב.

השתמש בפיפטה מתכווננת כדי למשוך זחל ולתת לו לשקוע לתחתית הקצה. זרוק את הזחל בנפח מינימלי של נוזל לאגרוז שחומם מראש, ואז משך את הדג עם אגרוז והוציא אותו במהירות לכלי זכוכית תחתון 35 מילימטר שהוכן בעבר. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש במכחול רגיל כדי למקם את החיה, או מספר בעלי חיים, בתוך האגרוז בצדדים, כך שהגוף והזנב יהיו שטוחים.

הניחו לדג המוטבע לשבת במשך 10 עד 15 דקות עד שהאגרוז מתייצב היטב. לאחר מכן, השתמש בכשני מיליליטר מי ביצים עם טריקאן כדי למלא בזהירות את צלחת הפטרי בגודל 35 מילימטר. הניחו את צלחת הפטרי עם זחל משובץ על במת המיקרוסקופ הקונפוקלי, ובאמצעות תאורת Brightfield והגדלה של פי 40, התמקדו בצד הגבי של חוט השדרה של החיה. עבור להגדרה פלואורסצנטית מתאימה, ודמיין את המבנה המעניין כדי לאשר שכל פרמטרי ההדמיה הם כנדרש לאבלציה שלאחר מכן.

כדי לקבוע את עובי המבנה לאבלציה בלייזר UV, השתמש בכונן Z כדי לאמת את החלק העליון והתחתון של המבנה המעניין על ידי מיקוד ידני למעלה ולמטה. רשום באופן ידני את מישור Z שיבוטל, לדוגמה, את מרכז התא. כדי לבצע אבלציה בלייזר, הפעל את אשף FRAP על ידי לחיצה על התפריט הנפתח בחלק העליון של תפריט התוכנה.

מהחלון החדש, קבע את פרמטרי התמונה עבור גישת האבלציה על ידי בחירת הפורמט, מהירות הסריקה והממוצע. אם מישור ה-Z לאבלציה עדיין לא נבחר, לחץ על הכפתור החי והתמקד דרך הדגימה עד שהמבנה הפלואורסצנטי, או מישור ה-Z הרצוי לביטול יהיה בפוקוס. לאחר הגדרת פרמטרי התמונה הכלליים, גש לשלב ההלבנה כדי לשלוט ברכיבי האבלציה הספציפיים, ולאחר מכן הפעל את הלייזר בגודל 405 ננומטר על ידי הפעלתו להליך ההלבנה.

לאחר מכן, השתמש באפשרות הזום כדי למקסם את עוצמת ההלבנה בהחזר ההשקעה שנבחר על ידי הקטנת שדה הסריקה, ובכך למקסם את זמן השהייה. בחר החזר ROI אחד או יותר עבור האבלציה באמצעות כל אחד מכלי הציור בחלון רכישת התמונה. כוון לגבעת האקסון, למשל, עם כלי הציור המעגלי של כ-4 עד 8 מיקרומטר.

לאחר קביעת ההחזר על ההשקעה, בחר בלחצן מסלול הזמן ואשר את מספר המחזורים שהחזר ה-ROI ייסרק ויבוטל. בחר את המסגרות שלפני ההלבנה ואחרי ההלבנה כרצונך כדי לאפשר סקירה כללית של התמונה כולה ממש לפני ומיד לאחר תהליך ההלבנה.

הגדרות אלה מאפשרות לחוקרים שכבות מרובות של עידון. באמצעות התאמת עוצמת הלייזר, מהירות הסריקה, ממוצע הקווים, גודל אזור העניין והחזרות, טכניקה זו מציעה רמה גבוהה של חופש לגרום ללחץ או מוות בתאים בודדים.

לאחר קביעת כל פרמטרי האבלציה הדרושים, לחץ על הפעל ניסוי ופקח על יעילות האבלציה. עיין בפרוטוקול הטקסט לפרטים נוספים.