הדמיה פלואורסצנטית כפולה לזיהוי אוליגודנדרוציטים מובחנים

קחו תרבית של תאי מבשר אוליגודנדרוציטים (OPCs), שבודדו ממוח גור חולדה, שהושרו להתמיין לאוליגודנדרוציטים. התאים מקובעים כדי לשמר את הארכיטקטורה התאית.

אוליגודנדרוציטים מובחנים מבטאים חלבון בסיסי של מיאלין, או MBP, סמן של אוליגודנדרוציטים בוגרים, בעוד שגם OPCs וגם תאים מובחנים מבטאים גורם שעתוק אוליגודנדרוציטים 2, או Olig2.

מרחו תמיסה חוסמת חדירות ודגרו עם תסיסה, חדירה לקרומי התאים וחסימת אתרי קשירה לא ספציפיים.

הוסף נוגדנים ראשוניים המכוונים לסמנים ודגירה בתסיסה כדי לאפשר קשירה.

שטוף כדי להסיר נוגדנים לא קשורים, ולאחר מכן הוסף נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור ספציפיים לנוגדנים הראשוניים ודגירה עם תסיסה.

שטפו את התאים, ואז הניחו אותם במערכת הדמיה פלואורסצנטית כפולה.

השתמש באור באורכי גל ספציפיים כדי לעורר את הפלואורופורים המובהקים ולזהות את האותות הנפלטים כדי לדמיין את הסמנים.

זהה אוליגודנדרוציטים מובחנים המבטאים olig2 ו-MBP בין ה-OPCs הלא מובחנים המבטאים רק olig2.

הביאו את הצלחת לטמפרטורת החדר. שאפו את הבארות, והוסיפו 250 מיקרוליטר של DPBS המכילים 5% NGS ו-0.1% טריטון X-100. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה עם טלטול אורביטלי עדין. הכן את תמיסת הדגירה העיקרית על ידי דילול נוגדן חד שבטי נגד MBP של עכבר ונוגדנים אנטי-OLIG2 רב-שבטיים של ארנב ב-DPBS המכילים 5% NGS. לאחר מכן, דגרו על הנוגדנים העיקריים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה למשך 16 עד 18 שעות עם טלטול אורביטלי עדין.

בזמן שטיפת הצלחת, הכינו את תמיסת הדגירה המשנית על ידי דילול הנוגדנים נגד עכבר 680 ואנטי ארנב 800 ב-DPBS המכילים 5% NGS. לאחר מכן, שאפו את הכביסה הסופית והוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת דגירה משנית. הגן על הצלחת מפני אור, ודגר אותה בטמפרטורת החדר למשך שעה עם טלטול אורביטלי עדין.

לאחר מכן, סרוק את הצלחת באמצעות מערכת הדמיה המסוגלת לזהות פליטות פלואורסצנטיות של 700 ננומטר ו-800 ננומטר. כנקודת התחלה, הגדר את היסט המוקד ל-3 ואת הרגישויות ל-1.5 עבור MBP, 5.0 עבור אקטין ו-3.5 עבור OLIG2. התאם את ערכי הרגישות לפי הצורך כדי למנוע חשיפת יתר של האות.