מדידת ביטוי חלבונים במוח מכרסמים באמצעות פלואורסצנציה קרובה לאינפרא אדום וסריקה ברזולוציה גבוהה

קחו שקופית זכוכית המכילה קטעי רקמת מוח של חולדות המוכתמים במערכת החיסון עבור קולטני AMPA ו-NMDA בתאי עצב באמיגדלה.

קולטני AMPA מתווכים זרם נתרן המושרה על ידי גלוטמט והעברה סינפטית מעוררת מהירה.

לעומת זאת, קולטני NMDA מתווכים את זרם הנתרן והסידן המושרה על ידי גלוטמט וקו-אגוניסט, מה שמקל על העברה סינפטית מעוררת איטית.

הקולטנים מוכתמים בנוגדנים ראשוניים ומזוהים באמצעות נוגדנים משניים מתויגים פלואורופור קרוב לאינפרא אדום.

הנח את השקופית עם צד הרקמה כלפי מטה על ממשק הסריקה האינפרא אדום הקרוב.

התאם את פרמטרי ההדמיה והתחל בהדמיה.

עם תאורת לייזר, הפלואורופורים על קולטני AMPA ו-NMDA פולטים פלואורסצנטיות.

הדמיה קרובה לאינפרא אדום ממזערת את האוטופלואורסצנטיות, ומשפרת את בהירות האות.

סריקה ברזולוציה גבוהה מבטיחה עוד יותר בידול ברור של אותות פלואורסצנטיים, ומאפשרת הדמיה מדויקת של קולטני AMPA ו-NMDA סמוכים באמיגדלה.

באמצעות תוכנת הדמיה, חשב את יחס עוצמת הקרינה של AMPA/NMDA באזור עניין ספציפי כסמן ללמידה וזיכרון.

הנח את השקופיות על ממשק סריקה כמעט אינפרא אדום כשהרקמה פונה כלפי מטה. צרו תמונות של שקופיות מרובות בו-זמנית באמצעות כלי בחירה. צלמו את השקופיות באמצעות הגדרת האיכות הגבוהה ביותר, ברזולוציה של 21 מיקרומטר. בהיסט של 0 ננומטר, ייבא תמונות לתוכנת ניתוח תמונות כדי להציג ולסמן לניתוח חלבון חצי כמותני.

לאחר פתיחת תוכנת ניתוח התמונה, בחר את אזור העבודה שאליו נסרקת התמונה. לאחר מכן, פתח את התמונה הסרוקה בתוכנת ניתוח התמונות כדי להציג את הסריקה, והתאם את אורכי הגל, הניגודיות, הבהירות וההגדלה המוצגים מבלי לשנות את התמונה הגולמית או את הפליטה הכמותית הכוללת.

לאחר זיהוי אזורי המפתח לכימות, בחר בכרטיסייה ניתוח לאורך החלק העליון של העמוד, ולאחר מכן בחר צייר מלבן כדי לצייר מלבן מעל האזור שיכומת. כדי להציג את גודל המלבן, בחר צורות לאורך הפינה הימנית התחתונה של המסך. לאחר מכן, בחר עמודות בפינה השמאלית התחתונה. לאחר מכן, הוסף עמודות גובה ורוחב כדי לזהות את גודל הצורה. לבסוף, תן שם לצורה וחזור על הפעולה. לאחר דגימת כל האזורים, המשך בשילוב וניתוח של הנתונים הזמינים מהכרטיסיה עמודות.