הדמיה של מיטוכונדריה בתוך סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים

התחילו עם קטע של רקמת עור אפידרמיס המכילה סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים או IENFs, קצות נוירונים תחושתיים דקים.

ה-IENFs עשירים במיטוכונדריה, ומספקים אנרגיה להעברת אותות נוירונים.

לרקמה יש IENFs, מיטוכונדריה וגרעיני אפידרמיס עם תווית פלואורסצנטית.

באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך, רכשו ברצף אותות פלואורסצנטיים בדידים באורכי גל מתאימים לגרעינים, IENFs ומיטוכונדריה.

הפעל סריקה חיה כדי ללכוד את אות ה-IENF, המקיף את שכבת האפידרמיס.

לאחר מכן, בצע סריקה רציפה עבור כל אות כדי למנוע דיבור צולב של אות פלואורסצנטי.

מהתמונה המשולבת, באמצעות התוכנה, חתוך ובודד את תאי האפידרמיס הכחולים.

לאחר מכן, עבדו את האזור שנחתך כדי לשפר את הרזולוציה של אותות IENF ירוקים ואותות מיטוכונדריאלים אדומים.

לאחר מכן, צור תמונת משטח תלת מימדית ליצירת מסכה עבור IENFs, ולאחר מכן שכב על תמונת פני השטח המיטוכונדריאלית כדי לבודד מיטוכונדריה ספציפית לעצב.

בפלט הסופי, IENFs מופיעים בציאן, בעוד שהמיטוכונדריה מופיעים כמבנים זעירים בצבע מג'נטה.

בחר את מטרת טבילת השמן פי 40 במיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר הפוכה. בחר את הלייזרים והגלאים המתאימים כדי לדמות את הגרעינים, סיבי העצב והמיטוכונדריה. הזן את פרמטרי הסריקה הבאים ברזולוציית עוצמת 12 סיביות של תוכנת המיקרוסקופ. קצב סריקה של 600 הרץ עם ממוצע של שתי מסגרות וזום של 2.2. הגדר את תוכנת המיקרוסקופ לרזולוציה רוחבית אופטימלית על ידי בחירת רזולוציית סריקה של 1024 על 1024. מטב את הרזולוציה הצירית והחיתוך האופטי על ידי בחירת צמצם קונפוקלי של יחידה אוורירית אחת בגודל צעד z של 210 ננומטר.

סרוק כל אות בנפרד, והתאם את מתח הגלאי והיסט כדי להסיר פיקסלים רוויים מעל ומתחת. הפעל סריקה חיה של האות העצבי, והתאם את בקרת המיקוד z כדי למצוא ולהגדיר את מישורי המוקד העליונים והתחתונים בתוכנת המיקרוסקופ המקיפים את האות העצבי בתוך קטע הרקמה. סרוק את סדרת z הסופית עם סריקה רציפה כדי למנוע ערב-דיבור של אותות פלורסנט.

בודדו את האפידרמיס משכבת הקרנית ומהדרמיס באמצעות ציור אזור סביב האפידרמיס, בעזרת כלי בחירה בתמונה משוכפלת של התמונה המקורית. לאחר מכן חתכו את התמונה לבחירה. חשב פונקציות פיזור נקודתיות עבור האותות הקונפקליים הקרינה הירוקה והאדומה, באמצעות תכונת חישוב פונקציית ההתפשטות. לאחר מכן הגדר את הפרמטרים עבור מקדם שבירה בינוני לנפט ב-1.515, ואת הצמצם המספרי עבור יעד נפט פי 40 ב-1.25. הגדר את חור הגלאי באזור אחד, יחידה ובחר אורך גל עירור לייזר.

השתמש בשחזור איטרטיבי המוגדר לביטחון של 100%, מגבלת איטרציה של 10 מחזורים ו-PSFs הירוקים והאדומים לדה-קונבולוציה של אותות הקרינה הירוקים והאדומים. השתמש בכלי יצירת משטח כדי ליצור משטח סביב אותות העצב המפותלים, ובחר תכונת חלק לא מסומנת, עוצמה מוחלטת לסף, סף תחתון של 3,000 וסף עליון של 65,535. שמור על המשטחים מעל 10 ווקסלים.

הסר את המשטחים שאינם עצביים באמצעות הכרטיסיה עריכה במשטח העצב כדי לבחור משטחים בודדים שאינם עצבים, או החזק את מקש Control לחוץ כדי לבחור משטחים מרובים שאינם עצביים. מחק את המשטחים שאינם עצביים שנבחרו על-ידי לחיצה על לחצן מחק. השתמשו בכרטיסייה 'עריכה' במשטח העצב, ולחצו על הלחצן 'מסיכה הכל' במאפייני המסיכה.

בחלון החדש, בחר ערוץ 5 מיטוכונדריה מפורק תחת בחירת ערוץ, ולאחר מכן סמן ערוץ כפול לפני החלת המסיכה. לחץ על לחצן הבחירה עבור קבוע מבפנים בחוץ, ובדוק את הווקסלים שנקבעו מחוץ למשטח ל-0.0. ולחץ על כפתור אישור.

לבסוף, צור משטחים ספציפיים למיטוכונדריה באמצעות הכלי Create Surface כדי ליצור משטח סביב האותות המיטוכונדריאלים המפותלים על ידי בחירה בתכונה Smooth לא מסומנת, ושימוש ב-Background Subtraction לסף. הגדר את קוטר הכדור הגדול ביותר ל-1.50 מיקרומטר, את הסף התחתון ל-2,000 ואת הסף העליון למקסימום 65,535. הקפד לשמור על המשטחים מעל 1.0 ווקסלים.