הדמיית פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית של הובלת נוירופילמנטים באקסונים של עכברים עם מיאלין

התחל עם מכלול זלוף המונח על במת מיקרוסקופ הפוך.

מכלול הזלוף מכיל עצב היקפי מנותח המאובטח בין כיסוי למגלשת מיקרו אמת מים עם זלוף מי מלח רציף.

האקסונים המיאליניים של העצב מבטאים את הנוירופילמנטים הירוקים המתויגים בפלואורופור.

באמצעות תאורת שדה בהיר, התמקדו באקסונים המיאלינים.

עבור למצב קונפוקלי, פוטו-אקונומיקה עם עוצמת לייזר גבוהה, ולאחר מכן צלם תמונת ייחוס אוטו-פלואורסצנטית נמוכה באמצעות עוצמת לייזר נמוכה.

צייר קווים מקבילים לאורך האקסון כדי להגדיר את אורך חלון הפוטו-אקטיביות. השתמש באפשרות זו כמדריך ליצירת אזור הפעלה מלבני.

האירו את האזור הזה באורך גל ספציפי כדי להפעיל את הנוירופילמנטים הירוקים המתויגים בפלואורופור, ולגרום להם להאיר. רכוש את התמונה.

לאחר ההפעלה, צלם תמונות דולג זמן.

עם הזמן, הנוירופילמנטים הפלואורסצנטיים נעים לשני הכיוונים ומתפשטים לאזורי אגף סמוכים.

הופעת הקרינה באזורים המאגפים הסמוכים לאזור ההפעלה מאשרת הובלה נוירופילנטית.

אחוז בקצה הפרוקסימלי של העצב והניח אותו לאט על החלקת כיסוי. לאחר מכן, יישר אותו במתח עדין. הנח את מגלשת המיקרו אקוודוקט מעל העצב כשהמגלשה המחורצת כלפי מטה ומקם את כיוון הזרימה במקביל לעצב. הפוך את מכלול החלקת הכיסוי ואמת המים המיקרו והנח אותו בבית תא הזלוף כשהמגלשה מנוגדת לאטם החיצוני.

כדי לאבטח את תא הזילוף, הנח אותו בבית המתכת וסובב את טבעת הנעילה. לחץ לאט על בוכנת מזרק המלח ומלא את תא הזלוף. שמור את צינורות הכניסה והיציאה, בקבוק היציאה והמזרק מוגבהים מעל החדר עצמו בכל עת במהלך ההתקנה וההדמיה. העבירו את מכלול הזלוף לשלב מיקרוסקופ הפוך והרכיבו את מזרק המלח למשאבת המזרק. לאחר מכן, הפעל את המנוע והתאם את המהירות לקצב זרימה של 0.25 מיליליטר לדקה.

חבר את תנור התמיסה המוטבע והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס. חבר את תנור המטרה והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס. מרחו שמן על המטרה והכניסו את תא הזלוף לתושבת הבמה. מרחו שמן על כרית תנור החימום והצמידו אותו לתא הזלוף. לאחר מכן, חבר אותו והגדר אותו ל-37 מעלות צלזיוס.

נעל את תא הזלוף לתוך מתאם ה-stage והביא את שמן האובייקטיבי למגע עם החלקת הכיסוי בצד התחתון של החדר. השתמש בתאורת שדה בהיר כדי להתמקד בשכבת האקסונים על המשטח התחתון של העצב הקרוב ביותר למשטח החלקת הכיסוי. ניתן לזהות אקסונים מיאליניים על ידי נוכחות של מעטפת מיאלין, הנראית תחת תאורת אור המועברת בשדה בהיר ללא שיפור ניגודיות.

רכוש תמונת ייחוס של שדה בהיר, תוך רישום כיווניות העצב. לאחר מכן רכוש תמונה קונפוקלית באמצעות לייזר 488 ננומטר ומסנן פליטה המתאים ל-GFP הניתן להפעלה פוטו-אקטיבית. הגדר את עוצמת הלייזר בערך פי חמישה מעוצמת ההדמיה הרגילה ורכוש תמונה עם זמן חשיפה של שלוש עד ארבע דקות. לאחר מכן רכוש תמונה קונפוקלית נוספת כדי לתעד את האוטו-פלואורסצנטיות לפני ההפעלה לאחר שלב ההלבנה.

צייר קו מקביל לאקסונים באורך השווה לגודל חלון ההפעלה הרצוי של תמונת השדה הבהיר. השתמש בקו זה כמדריך, צייר אזור מלבני מעניין על פני שדה הראייה בניצב לאקסונים. הפעל את הקרינה של GFP באזור זה על ידי עירור דפוס עם האור של 405 ננומטר, וודא שהתמונה נרכשת ממש לפני ומיד לאחר ההפעלה. בסיום ההפעלה, הפעל טיימר של דקה אחת. כשהוא כבוי, התחל לרכוש סדרת דולג זמן.