מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיית מורפולוגיה עצבית בגור עכבר

התחל בהגדרת אור העירור עבור המיקרוסקופ בעל שני הפוטונים.

קחו גור עכבר טרנסגני מורדם עם חלון הדמיה עגול מזכוכית ולוחית ראש מושתלת בגולגולתו.

הנוירונים מבטאים חלבונים פלואורסצנטיים אדומים כדי להקל על ההדמיה.

נקה את חלון ההדמיה מזכוכית ואבטח את הגור על שלב ההדמיה של שני פוטונים.

יישר את חלון ההדמיה עם מטרת המיקרוסקופ על ידי התאמת ראש הגור.

השתמש בכרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של הגור.

התאם את קצב זרימת ההרדמה.

מרחו טיפת מים על הכיסוי, ולאחר מכן הורידו את עדשת האובייקט של המיקרוסקופ.

מיקרוסקופיה דו-פוטונית משתמשת בשני פוטונים של אור כדי להפעיל חלבונים פלואורסצנטיים, מה שמאפשר הדמיה עצבית מפורטת עם רעשי רקע מינימליים והלבנת פוטו

צלם תמונות של הנוירונים בעומקים שונים כדי לדמיין את המבנה שלהם

לבסוף, ערמו את התמונות כדי ליצור ייצוג תלת מימדי של הנוירון, כולל ההקרנות העצביות שלהם, כדי לחקור שינויים מורפולוגיים הקשורים לגדילה.

כדי להתחיל בהדמיה, הגדר תחילה את אורך הגל של לייזר שני פוטונים. לעירור RFP, השתמש באורך גל של 1,000 ננומטר. נגב את פני הכיסוי עם 70% אתנול. חבר את הגור המורדם לצלחת הטיטניום בשלב ההדמיה באמצעות מוט הטיטניום. השתמש בגוניומטרtagה כדי לכוונן את הראש כך שהחלקת הכיסוי תהיה מקבילה לעדשת האובייקטיב.

שמרו על טמפרטורת הגוף של הגור במהלך ההדמיה, באמצעות כרית חימום המוגדרת ל-37 מעלות צלזיוס, והפחיתו את ריכוז האיזופלורן ל-0.7% עד 1%. מקם את שלב ההדמיה מתחת לעדשת האובייקט 20X של המיקרוסקופ הדו-פוטוני. מרחו טיפה אחת של מים על החלקת הכיסוי.

הגדר את התוכנה לרכוש תמונות z-stack במרווחים של 1.4 מיקרון. עבור הדמיית נוירונים בשכבה ארבע, הגדר את רוחב ה-z בין 150 ל-300 מיקרון כדי לדמות את כל המורפולוגיה הדנדריטית. השתמש בסריקה איטית ובממוצע כדי לקבל תמונות ברורות המציגות את המורפולוגיה העצבית.

בדרך כלל לוקח יותר מ-20 דקות לרכוש את כל המורפולוגיה הדנדריטית.