הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים של צבירת חלבון PolyQ בנוירונים של Caenorhabditis elegans

התחל עם תולעי בקרה מורדמת, תואמת גיל ותולעי Caenorhabditis elegans חסרות מלווה.

שתי הקבוצות מבטאות חלבוני polyQ מתויגים פלואורופור בתאי העצב שלהן המועדים לקיפול שגוי.

בתולעי ביקורת, חלבוני צ'פרון מגבילים צבירת polyQ לא מקופלת כהלכה, בעוד שבתולעים עם מחסור במלווים, polyQ לא מקופל יוצר בקלות אגרגטים.

הניחו את שקופית הבקרה על במת מיקרוסקופ קונפוקלי עבור מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי לכל החיים (FLIM).

האירו את התולעים באמצעות לייזר פולס.

הלייזר מעורר את הפלואורופור, אשר פולט פוטון כשהוא חוזר למצב הקרקע.

FLIM מודד את אורך החיים הקרינה – משך הזמן שהפלואורופור נשאר במצב מעורר שלו.

בתולעים חסרות מלווה, צבירת polyQ מאגדת פלואורופורים, מקדמת העברת אנרגיה בין פלואורופורים סמוכים במקום פליטת פוטונים, ובכך מפחיתה את חיי הקרינה.

תוכנת FLIM מעבדת את תקופות החיים הללו כדי ליצור מפות מקודדות בצבע, המאפשרות הדמיית צבירה.

אורך חיים מופחת של פלואורסצנטיות בתולעים חסרות מלווה, בהשוואה לביקורת, מעיד על צבירת polyQ מוגברת.

ודא שהנמטודות אינן זזות לחלוטין. פתח את תוכנת הרכישה של FLIM. אתר את כפתור הכרטיסייה ולחץ על הפעל יציאות. הנח את השקופית עם C. elegans המותקן על הבמה, ובאמצעות עדשת הגדלה פי 10 במצב שידור, מקם את מיקום הנמטודות על השקופית. הסר את השקופית, העבר את המטרה לעדשת הגדלה פי 63 והחל את מדיום הטבילה הנדרש.

הניחו את השקופית על הבמה ומקמו את הנמטודות. התחל לסרוק את הדגימה. בחר אזור עניין והתמקד במישור ההקרנה המרבי שלו. בממשק של תוכנת FLIM, תצוגה מקדימה של מספר הפוטונים שזוהו. ערך ה- ADC צריך להיות בין 1 כפול 10 לרביעי ו- 1 כפול 10 לחמישי. במידת הצורך, העבר את המיקוד למישור אחר או הגדל את עוצמת הלייזר כדי לאסוף יותר פוטונים.

- ודא שאתה נמנע מערימת פוטונים, אך אסוף כמות מספקת של פוטונים כדי ליצור התאמה ומדידה טובה לכל החיים.

- בשורת התפריטים, בחר בכרטיסייה כדי להגדיר את פרמטרי הרכישה. בחר סרוק סנכרון כדי לאפשר זיהוי פוטון בודד. הגדר את הרכישה לפרק זמן קבוע או למספר קבוע של פוטונים. לחץ על התחל כדי להתחיל ברכישה. פתח את התוכנה וייבא קבצי נתונים של FLIM באמצעות קובץ, טען נתוני FLIM. טען את כל הדגימות ממצב אחד, גם אם הושגו במפגשים שונים ומחזרות ביולוגיות שונות.

במידת הצורך, פלח נמטודה בודדת עבור תמונות FLIM רבות באמצעות סגמנטציה, מנהל סגמנטציה. גרור את כלי החיתוך סביב אזור העניין עד שהוא מסומן. לאחר שתסיים, לחץ על אישור. בחר אזור קטן שבו מופיעה התמונה מבוססת העוצמה של C. elegans. עקומת הדעיכה של אזור זה מופיעה בחלון הדעיכה הגדול בצד ימין של הממשק.

כדי להעריך את אורך החיים בכרטיסייה נתונים, הגדר ערך מינימלי משולב שרירותי בין 40 ל- 300 כדי לא לכלול פיקסלים עמומים מכדי לייצר התאמה טובה. בחר מינימום זמן ומספר מקסימלי זמן כדי להגביל את אות FLIM לערכים אלה. אל תשנה את הפוטון של ספירת הפוטונים המוגדרים מראש של אחד. הזן את קצב החזרה במגה-הרץ של הלייזר המשמש במהלך הרכישה.

הזינו ערך שער מרבי כדי לא לכלול את כל הפיקסלים הרוויים. בכרטיסיה אורך חיים, בחר התאמה כללית לשימוש. אל תשנה שום פרמטר אחר מלבד מספר הברירה המעריכית אם ידוע שדעיכת הקרינה שנבחרה היא רב-מעריכית ומציגה יותר מאורך חיים אחד.

העלה את ה-IRF דרך תפריט ה-IRF. כדי להעריך את משמרת ה- IRF, בחר IRF, הערכה, הזזת IRF. קבוצת ערכים מופיעה באופן אוטומטי בכרטיסיה IRF. לאחר קביעת זה, אל תשנה פרמטרים אחרים בכרטיסייה זו. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על התאם ערכת נתונים. ההתאמה המתקבלת המודגשת בקו כחול צריכה להיות חופפת לכל האירועים. התאמה טובה מתקבלת כאשר כל האירועים מיושרים לאורך ההתאמה.

לחץ על פרמטרים הכרטיסייה הממוקמת בתפריטים השמאליים העליונים של ממשק התוכנה, ובחר סטטיסטיקה, ממוצע משוקלל ובדוק שערך חי בריבוע קרוב ככל האפשר לאחד. ערך אורך החיים של התמונה שנבחרה מתגלה אפוא כ-tau 1. ייצא כל מידע שמעניין אותך באמצעות File, Export Intensity Images, Fit Result Table, Images, Histograms.