מיקרוסקופיה דו-פוטונית לניטור דינמיקת סידן בקולטני אור של חרוט רשתית עכבר

הנח כיסוי המכיל רקמת רשתית עכבר המותקנת על קרום מתחת למיקרוסקופ דו-פוטוני.

הרקמה מבטאת חיישן ביולוגי של סידן מבוסס FRET בקולטני אור חרוטים.

באמצעות מטרת טבילה במים, התמקדו ברקמה.

תחת תאורת רקע, מסופי אקסון החרוט נשארים דה-פולריזציה, ומאפשרים זרימת סידן.

קשירת סידן תוך תאית משנה את הקונפורמציה של החיישן הביולוגי, ומקרבת את הפלואורופורים התורם והמקבל.

התחל הדמיה של שני פוטונים.

הלייזר של המיקרוסקופ ממקד אור קרוב אינפרא אדום באנרגיה נמוכה לתוך הרקמה.

בנקודת המוקד של הלייזר, שני פוטונים מעוררים בו זמנית את החיישן הביולוגי, ומפעילים העברת אנרגיה מהתורם למקבל.

זה מגביר את הקרינה המקבל תוך הפחתת הקרינה של התורם.

חשב את יחס הקרינה.

לאחר מכן, ספק גירוי אור כדי להקטיב את הקונוסים, ולהפחית את רמות הסידן התוך תאי.

זה מחזיר את הקונפורמציה של החיישן הביולוגי, מעכב את העברת האנרגיה מהתורם למקבל ומוריד את יחס הקרינה.

רשום את התגובות כדי לנתח דינמיקת סידן מעוררת אור במסופי אקסון חרוט.

העבירו פרוסה מתא ההחזקה לתא ההקלטה והתחילו מיד להחדיר אותה בתמיסה חוץ-תאית פחמימות. שמור על קצב זרימת זלוף של 2 מיליליטר לדקה וטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתא ההקלטה. השתמש במטרת טבילה במים של 20x, 0.95 NA ובמצלמת CCD בשילוב עם נורית אינפרא אדום מתחת לתא ההקלטה כדי לאתר את פרוסת הרשתית.

הפעל את מערכת ההדמיה הדו-פוטונית, כפי שצוין על ידי היצרן. לאחר מכן, הפעל את הלייזר והגדר אותו ל-860 ננומטר. הפעל את שני ערוצי הזיהוי להדמיה פלואורסצנטית של ECFP וציטרין. לאחר מכן, באמצעות תוכנת רכישת התמונה, שלוט במיקרוסקופ דו-פוטוני כדי לסרוק ולבחור שורה של מסופי חרוט להקלטה. הגדר רכישת תמונות לתמונות בגודל 128 על 16 פיקסלים או תצורה דומה.

הגבל את האזור הסרוק למסופי החרוט כדי למנוע הלבנה של פוטופיגמנטים במקטעים החיצוניים. הפעל את הלייזר. אפשר לקונוסים להסתגל ללייזר הסורק ולאור הרקע של הגירוי למשך 20 עד 30 שניות לפני הצגת גירויים קלים או שימוש בחומרים פרמקולוגיים. כעת, התחל בהצגת הגירויים השרירותיים. הגירויים נוצרים על ידי אפנון עוצמת שתי נוריות הלד לאורך זמן, באמצעות לוח מיקרו-מעבד הנשלט על ידי תוכנה מותאמת אישית. לאחר מכן, התחל להקליט את שני ערוצי הקרינה בו זמנית באמצעות תוכנת רכישת התמונה המתאימה.