הדמיית תאים חיים של נדידת גרעין גליית מולר במהלך התחדשות רשתית דג הזברה

התחל עם צמח רשתית גבי משובץ אגרוז מדג זברה טרנסגני, המותקן בפלואורודיש עם מדיה.

הרשתית מציגה נזק לקולטני אור המושרה על ידי אור ומכילה תאי גליה של מולר או MGCs עם גרעינים המבטאים GFP.

מניחים את המנה בתא מיקרוסקופ מולטיפוטון.

באמצעות תאורת שדה בהיר, התמקד ברשתית.

עבור למצב פלואורסצנטי כדי לאתר את ה-MGC.

הגדר מחסנית z משכבת תאי הגנגליון או GCL לשכבה הגרעינית החיצונית או ONL.

התחל הדמיה חיה.

קולטני אור פגומים משחררים TNF-α, ומפעילים את ה-MGC.

גרעיני MGC נודדים באופן בסיסי בתוך השכבה הגרעינית הפנימית או INL כדי לשכפל את ה-DNA שלהם.

לאחר מכן, הגרעינים נודדים אפיקלית ל-ONL כדי לעבור מיטוזה, ומייצרים אבות עצביים.

לאחר המיטוזה, גרעיני ה-MGC והאבות הקדמונים נודדים בחזרה ל-INL.

האבות הקדמונים מתרבים, נודדים לאתר הפגיעה ומתמיינים לקולטני אור, מה שמאפשר התחדשות רשתית.

נתח את התמונות שצולמו כדי לדמיין הגירה גרעינית.

בתוכנה לרכישת תמונות, פתח חלונות A1 MP GUI, TiPad, A1 Compact GUI ו-ND Acquisition. עבור הדמיה מרובת פוטונים, ודא שאפשרות IR NDD נבחרה בחלון ממשק המשתמש הקומפקטי A1. לאחר מכן, בשדה ההגדרה, בחר IR-DM עבור המראה הדיכרואית הראשונה ובדוק שמסנן מעבר הפס מוגדר ל-525 עד 50 כדי להשיג פלואורסצנטיות GFP.

לאחר מכן, הפעל את לייזר ה-IR בחלון ממשק המשתמש הגרפי A1 MP. ייקח כמה דקות עד שהלייזר יהיה מוכן. לאחר מכן, הגדר את אורך הגל ל-910 ננומטר כדי לעורר את הקרינה של GFP וליישר את הלייזר על ידי לחיצה על כפתור היישור האוטומטי.

לאחר הנחת תרבית הרשתית על שלב המיקרוסקופ הרב-פוטוני, ודא שאורות החדר והציוד כבויים לפני פתיחת התריס כדי למנוע חשיפת יתר של צינור מכפיל הפוטו. כדי להפחית את רמות הרעש, שכן את המיקרוסקופ בסביבה חשוכה.

קבל תמונות של שדה ראייה של 300 על 300 פיקסלים בזום של 2, המוגדרים בחלון אזור הסריקה, וזמן שהייה של פיקסלים של 4.8 מיקרו-שניות לפיקסל שנבחר בחלון ממשק המשתמש הקומפקטי A1. הגדר באופן גס את עוצמת הלייזר על ידי שינוי אזור הרכישה בחלון ה-GUI של A1 MP והרווח בחלון ה-GUI הקומפקטי של A1.

כעת, התמקדו בשכבת תאי הגנגליון והגדירו את מישור המוקד העליון של מחסנית ה-z בחלון המשנה Z בתוך חלון רכישת ה-ND. העבר את מישור המוקד דרך רמת השכבה הגרעינית החיצונית, המאופיינת בנוכחות של תאים חיוביים GFAP ו-GFP המסומנים במעומעם שהם עגולים ומוגדלים ביחס לעמיתיהם בשכבה הגרעינית הפנימית.

הגדר מישור זה כתחתית ערימת ה-z. לאחר מכן, הגדר את גודל צעד z בין 0.7 ל -1 מיקרומטר. כדי להגדיר את תיקון עוצמת z, פתח את חלון תיקון עוצמת Z ובחר מ-ND להגדרת טווח מחסנית z. לאחר מכן, לחץ על מישור המוקד התחתון בחלון תיקון עוצמת Z והגדר את עוצמת הלייזר והרווח

לאחר מכן, לחץ על החץ לצד ערכי z בחלון תיקון עוצמה Z כדי לאשר את ההגדרות המוצגות לאחר מכן תחת הגדרות התקן בחלון תיקון עוצמת Z עבור מישור המוקד שנבחר. חזור על התהליך עבור המישור האמצעי והעליון, והגדל את עוצמת הלייזר והרווח.

הגדר את אזור הרכישה בחלון ממשק המשתמש הגרפי של A1 MP והימנע מבחירת אזור רכישה גדול מ-15 והגבר גבוה מ-126 בתחילת ההדמיה כדי לעקוף פוטו-הלבנה ורמות רעש מוגברות. לאחר מכן, בחר תיקון עוצמה יחסית בחלון Z Intensity Correction. בחלון המשנה של סדרת הזמן של חלון רכישת ND, הגדר את משך הזמן לשמונה שעות ואת המרווח ללא עיכוב. לאחר מכן, לחץ על הפעל תיקון Z בחלון המשנה Z-Stack של חלון רכישת ND כדי לרכוש סדרות זמן תלת מימדיות.