מיקרוסקופיה הולוגרפית דו-פוטונית לחקר פעילות עצבית וקישוריות במודל עכבר

התחל עם עכבר ער הממוקם מתחת למיקרוסקופ הולוגרפי בעל שני פוטונים המשולב עם מאפנני אור מרחבי או SLM.

העכבר מחזיק לוחית ראש מושתלת מראש.

במוח העכבר, תאי עצב מבטאים תעלות רגישות לאור אדום ומדדי סידן פלואורסצנטיים ירוקים שנקשרים ליוני סידן.

כדי לחקור פעילות עצבית וקישוריות, הגדר את פרמטרי ההדמיה.

השתמש בלייזר של 920 ננומטר כדי לעורר אינדיקטורים הקשורים לסידן בתוך הנוירונים. צלם את תמונת הקרינה של תא העצב עם נזק אור מינימלי

אפס את פרמטרי ההדמיה ומקד קרן לייזר קרובה לאינפרא אדום.

SLMs מעצבים את קרן הלייזר לתבניות הולוגרפיות מדויקות המאפשרות התמקדות סלקטיבית בנוירוני מטרה במספר נקודות.

זה ממריץ תעלות רגישות לאור, גורם לזרם יוני סידן ומשפר את הקרינה של נוירוני המטרה.

נוירוני המטרה המופעלים מעבירים אותות לתאי העצב המחוברים ומגבירים את הקרינה של הנוירון המחובר.

שוב, צלם תמונה של שני פוטונים. פלואורסצנטיות מוגברת בנוירוני מטרה ומחוברים מאשרת פעילות עצבית וקישוריות.

לאחר הנחת העכבר מתחת למיקרוסקופ וביצוע הדמיה של שני פוטונים, פתח את תוכנת ההדמיה המסחרית. במצב הדמיה חיה, כוונן את המתח של גלאי התמונה ואת עוצמת לייזר ההדמיה, כדי לייעל את בהירות הנוירונים המבטאים GCaMP6m-P2A-ChRmine. צלמו תמונות של הנוירונים המבטאים את החלבונים הללו, ולאחר מכן האירו את הנוירונים הספציפיים בעקבות ההליך שהוצג קודם לכן.

כדי לחקור את הקישוריות התפקודית בתוך נוירונים בשכבה 2 ו-3, השתמש במודולטור אור מרחבי כדי ליצור דפוסים הולוגרפיים של גירוי אופטוגנטי. ושלבו אותו עם הדמיית סידן דו-פוטונית. הגדר את עוצמת לייזר ההדמיה ל-920 ננומטר ב-10 עד 20 מילי-וואט, ואת שדה הראייה ל-256 מיקרומטר על 256 מיקרומטר. נמדד בעומק של 100 עד 150 מיקרומטר מפני השטח של קליפת המוח.

הגדר את זמן השתהות הפיקסלים ל-1.5 מיקרו-שניות עבור 2 הרץ, או 100 ננו-שניות עבור 30 הרץ. השתמש גם ב-2 הרץ וגם ב-30 הרץ כקצב הפריימים של ההדמיה כדי לראות אם גירוי הולוגרפי יחיד גרם לתגובת סידן בתאי העצב. הגדר את עוצמת לייזר הגירוי ההולוגרפי המגרה נוירון בודד ב-10 מילי-וואט, וזה מספיק כדי לגרום לפעילות עצבית.

במקביל, דמו את תגובת יוני הסידן ב-920 ננומטר, עם 10 גירויים הולוגרפיים במרווחים של 1,040 ננומטר ושמונה שניות למשך זמן של 50 מילישניות לאחר פרק זמן בסיסי של 10 שניות.