הדמיה של נדידת תאי פסגה עצבית בעובר דג זברה באמצעות הדמיית זמן-lapse מרובת פוטונים

התחל עם עובר דג זברה טרנסגני חי ונטול כוריון המוטבע באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה ומונח בתא מלא במדיה עוברית.

העובר מבטא תאי פסגה עצבית משופרים של חלבון פלואורסצנטי ירוק (EGFP).

מקם את החדר על במת המיקרוסקופ. באמצעות תאורת שדה בהיר, התאם את המטרה למיקוד ומרכז את העובר בשדה הראייה.

עברו למטרת הטבילה במים והתמקדו מחדש בעובר.

התאם את פרמטרי ההדמיה כדי להשיג תמונות Z-stack מהקצה הצדדי לקצה המדיאלי, וללכוד את רוחב העין.

כבה את תאורת השדה הבהיר, כסה את ה-stagה והתחל הדמיית זמן-lapse.

מלאו מחדש את החדר במדיה לפי הצורך במהלך ההדמיה.

תחת תאורת לייזר, תאי הפסגה העצבית זוהרים.

דמיין את נדידת התאים הללו מהצינור העצבי לאזורי הגולגולת, סביב העין המתפתחת כדי לאכלס את המזנכימה הפרי-עינית ואת התהליך הפרונטונזאלי, ובאופן גחוני ליצירת קשתות הלוע.

לאחר הנחת כל המערך על במת המיקרוסקופ, על פי פרוטוקול הטקסט, השתמש במטרה חמש פעמים כדי לאתר את העובר. לאחר מכן הרם את הבמה באופן ידני למיקום הגבוה ביותר, והשתמש במיקוד העדין כדי למקם את העובר באמצע טווח המיקרוסקופ.

הורד ידנית את הבמה, ושנה את יעד חמש הפעמים ליעד הטבילה במים פי 25. הרם בזהירות את הבמה כדי להחזיר את העובר לפוקוס. בתוכנה, לחץ על מצב xyzt להשגת תמונות מרובות בכל פעם או במרווחי t במישור xy על פני עומק z.

השתמש בתצוגת האפיפלואורסצנציה או השדה הבהיר כדי למצוא את עומק המיקוד באזור העניין, אשר יתחם את מחסנית ה-z. עבור ניסויים אלה, הקצה הצדדי של העין הוא תחילתה של ערימת ה-z. כאשר אתה ממוקד כאן בתוכנה, לחץ על כפתור התחל. לאחר התמקדות עד לקו האמצע של העובר, שהוא קצה ערימת ה-z, לחץ על כפתור סיום.

שלב קריטי הוא לוודא שצעד z מקיף את תחום העניין. במקרה שלנו, אנו רוצים ללכוד את רוחב העין מהקצוות הצדדיים למדיאליים.

לחץ על התפריט להתאמת זמן הרכישה ותדירות ההדמיה. להתאוששות נאותה של הפלואורופור והישרדות העובר, אפשר יחס של לפחות 1 עד 3 בין רכישת מחסנית z כאשר כוח הלייזר מופעל, לבין זמן ההתאוששות כאשר כוח הלייזר כבוי. עם הזמן המתאים להתאוששות העוברים, הגדר את הזמן בין ערימות z לחלון המיועד. לאחר מכן הגדר את משך הזמן הכולל לניסוי בחלון המתאים.

כעת הפעל את הגדרת התמונה החיה כדי לבצע התאמות אחרונות להגדרות הלייזר. התאם את פסי המחוון של שידור לייזר, רווח והיסט בתוך התוכנה כדי לייעל את תמונת הקרינה. כמו כן, התאם את כיוון העובר לפי הצורך בהתאם לאורך הניסוי, הצמיחה הצפויה של העובר וכו'. ודא שאזור העניין נשאר בתוך המסגרת לאורך כל הניסוי.

במהלך רכישת זמן-lapse, כבה את מקור האור האפיפלואורסצנטי. כסו את הבמה בקופסת הבטיחות בלייזר, המתאימה להגנה מפני אור רקע. לאחר מכן לחץ על התחל.

גש לתא האמבטיה הפתוח דרך דלתות ההזזה בקופסת הבטיחות בלייזר כדי למלא אותו במדיום עוברי דולג זמן כל 8 עד 12 שעות. לאחר רכישת ההדמיה, פתח את הקבצים בתוכנת עיבוד התמונה. הדגש את סדרת התמונות הנכונה.

בתוכנה, בחר בתפריט תהליך. לחץ על 3D Deconvolution והחל כדי לפרק כל מחסנית z. ייבא קבצי TIFF בודדים לתוכנת עיבוד וידאו. לאחר מכן בחר את כל קבצי ה-TIFF וגרור אותם לעורך הווידאו. התאימו את האורך של כל תמונה בסרטון ל-0.1 שניות. לבסוף, ייצא את הסרטון כקובץ MOV או MP4.