JoVE Encyclopedia of Experiments
מדעי המוח
0 צפיות • 3:06 דק' • June 17th, 2025
התחל עם זחלי דג זברה טרנסגניים מורדמים בתא הרכבה המכיל חיץ פיזיולוגי מחומצן תחת סטריאומיקרוסקופ.
המוח הקטן במוח מכיל נוירוני פורקינג'ה מהונדסים גנטית המבטאים חלבונים ציטופלזמיים פלואורסצנטיים.
הסר עודף מדיום, ולאחר מכן הוסף אגרוז מותך כדי לשתק את הזחלים להדמיה יציבה.
כוון את הצד הגבי של הזחלים כלפי מעלה כדי לדמיין את המוח הקטן.
לאחר ההתמצקות, יש לחתוך עודפי אגרוז. בעזרת מחט זכוכית, כרתו את העור הפיגמנטי המכסה את המוח כדי לחשוף אותו.
הפוך את בלוק האגרוז על תא הדמיה המכיל אגרוז מותך להדמיה תחת מיקרוסקופ הפוך.
הוסף את המאגר הפיזיולוגי כדי לשמר את תפקוד העצבים.
מקם את החדר מתחת למיקרוסקופ קונפוקלי הפוך. השתמש באור עירור כדי לעורר את החלבונים הפלואורסצנטיים, מה שמאפשר הדמיה של הנוירונים המסומנים
תאי העור הפיגמנטיים, אם לא מוסרים, מתפזרים וסופגים את אור העירור, ומפחיתים את עוצמת הקרינה.
הסרת העור משפרת את חדירת האור כדי לשפר את עוצמת הקרינה, מה שמקל על הדמיית נוירונים.
כדי להטמיע את הזחל, השתמש בפיפטה של פסטר כדי להעביר את הזחל המורדם לתא הרכבה תחת סטריאומיקרוסקופ. אם זחל כלשהו עדיין מסוגל לנוע, אל תשתמש בדג לניסוי עד שהדג אינו מסוגל לזוז לחלוטין. כאשר הזחל אינו זז, הסר בזהירות את המדיום העודף והוסף מיד לפחות 1 מיליליטר של אגרוז נמס נמוך על הזחל.
כוונו את דג הזברה כשאזור הגב פונה כלפי מעלה קרוב ככל האפשר לפני השטח של האגרוז. אם הזחלים יצולמו באמצעות מיקרוסקופ הפוך, לאחר ההתמצקות, חתוך את האגרוז המכיל את הזחל לגוש קובייתי קטן. כדי לחשוף את המוח להדמיה, חתוך את עודפי האגרוז מעל אזור העניין במוח לפי הצורך, והשתמש במחט זכוכית כדי לבצע חתך קטן דרך העור ליד אך לא מעל אזור העניין, מבלי לחדור עמוק מדי לתוך הרקמה.
בקושי מזיזים את המחט ממש מתחת לפני העור, המשיכו לבצע בזהירות חתכים קטנים מאוד סביב אזור העניין עד שניתן יהיה להסיר או לדחוף את העור מעל אזור העניין הצידה. לאחר שהרקמה הוסרה מכל העוברים, הוסף טיפה קטנה של אגרוז נמס נמוך לתא הדמיה שהוכן קודם לכן במיקרוסקופ הפוך, והשתמש במרית קטנה כדי להפוך את גוש האגרוז הקובייתי ב-180 מעלות על טיפת האגרוז בתא ההדמיה. כאשר האגרוז התמצק, מלאו את תא ההדמיה ב-ACSF טרי והתחילו לדמות את הזחל.