הדמיה קונפוקלית של דינמיקה דנדריטית עצבית באקספלנטים של רשתית עכבר

התחל עם עכבר חי לאחר הלידה המותקן על מסנן ממברנה ומונח בתא דגירה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי.

הרשתית עוברת טרנספטציה כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי בקרומים של אינטרנוירונים אמקרינים מתפרצים.

הנח משקל דגימה רטוב מראש על הרשתית כדי לייצב אותה.

מלאו את החדר במאגר.

שמור על זרימת חיץ וטמפרטורה אופטימליים בתא כדי לשמור על כדאיות עצבית.

מקם יעד טבילה במים בתא ההדמיה.

התחל הדמיה אפיפלואורסצנטית.

אור הלייזר, המכוון דרך המטרה, מעורר את החלבון הפלואורסצנטי בתאי האמאקרין.

הקרינה הנפלטת נלכדת דרך אותה מטרה, ומאפשרת הדמיה של תאי האמאקרין המסומנים

זהה תא פלואורסצנטי בהיר להדמיה.

הגדר את פרמטרי ההדמיה.

צלם תמונות במישורי Z מרובים כדי להשיג הדמיה תלת-ממדית של המורפולוגיה הדנדריטית השלמה.

בצע הדמיית זמן-lapse כדי לעקוב אחר שינויים במורפולוגיה דנדריטית לאורך זמן.

הרכיבו את תא הדגירה של ההדמיה החיה ומלאו אותו ב-aCSF מחומצן. הפעל את המשאבה ואת בקר הטמפרטורה, וודא שהטמפרטורה לא תעלה מעל 34 מעלות צלזיוס. זה יכול לקחת עד שעה עד שטמפרטורת החדר מתייצבת. מומלץ להקים את תא הדגירה לפני תחילת דיסקציית הרשתית. טמפרטורת תא יציבה מסייעת בהפחתת סחף הדגימה.

כדי להעביר את התלולית השטוחה ברשתית לתא הזילוף, עצור את המשאבה והסר את ה-aCSF שנמצא בתא. לאחר מכן, הנח את דיסק ה-MCE עם תושבת הרשתית השטוחה לתוך תא הדגירה. הרטיבו מראש משקל דגימה כדי לשבור את מתח הפנים, ולאחר מכן הניחו אותו על התלולית השטוחה, וודאו שמשקל הדגימה מונח על נייר ה-MCE כדי להפחית את סחף הדגימה. מלאו מחדש את החדר ב-aCSF המחומם והפיצו aCSF במהירות של כ-1 מיליליטר לדקה.

מקם את חתיכת האף עם מטרת טבילת המים פי 25 לתוך תא ההדמיה. מסך תאים מסומנים בעלי עניין באמצעות אור אפיפלואורסצנטי, והתאם את נפח ההדמיה כדי ללכוד תכונות דנדריטיות מעניינות.

באמצעות טבלת חיפוש המזהה פיקסלים רוויים מדי ותת-רוויים, התאם את עוצמת הלייזר כך שלא יהיו פיקסלים רוויים יתר על המידה. רכוש את נפח ההדמיה התלת מימדית וחזור על הרכישה בקצב הפריימים הרצוי. ניתן לכוונן את נפח ההדמיה בין כל נקודת זמן כדי לפצות על סחף הדגימה.